環(huán)介導(dǎo)恒溫擴(kuò)增法快速檢測曲霉菌的研究

章白苓 ，徐軼 ，杭亞平 ，張楠 ，鄒珊

（1.南昌大學(xué)第二附屬醫(yī)院檢驗科，江西 南昌 330006；2.江西省人民醫(yī)院，江西 南昌 330006）

曲霉菌屬 （Aspergillus）是侵襲性曲霉菌病等的嚴(yán)重條件致病菌，部分患者病死率高達(dá)90%[1，2]，目前，臨床曲霉菌感染均依據(jù)臨床癥狀，培養(yǎng)分離等方法。近年來PCR技術(shù)被應(yīng)用于曲霉菌的鑒定，但需要核酸擴(kuò)增儀等昂貴儀器和專業(yè)操作人員,檢測時間還是比較長,并且反應(yīng)過程容易受污染的影響。本研究采用環(huán)介導(dǎo)恒溫擴(kuò)增 （Loop-mediated Isothermal Amplification LAMP）技術(shù),設(shè)計 2對引物來識別目標(biāo)基因的6個不同區(qū)域,建立一種快速，簡便，經(jīng)濟(jì)檢測曲霉菌的方法,通過肉眼直接觀察顏色變化來判斷結(jié)果，并初步應(yīng)用于臨床?，F(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 臨床標(biāo)本和標(biāo)準(zhǔn)菌株來源 臨床標(biāo)本（痰液）來自南昌大學(xué)第二附屬醫(yī)院臨床微生物室,煙曲霉ATCC96918、黃曲霉 ATCC11492,來自上海復(fù)祥生物科技有限公司,白念珠菌ATCC 90029、熱帶念珠菌 ATCC66029、大腸埃希菌 ATCC 25922、金黃色葡萄球菌ATCC25923、銅綠假單胞菌ATCC27853、肺炎鏈球菌ATCC49619為本室保存。

1.1.2 儀器和試劑 Vitek-2全自動微生物分析儀(法國生物梅里埃)、PCR擴(kuò)增儀(美國ABI公司),Bst聚合酶（美國NEB公司），DNA marker(上海生工技術(shù)有限公司),試劑盒和熒光染料購自日本榮妍化學(xué)株式會社。DNA提取試劑盒購自廣州達(dá)安基因公司。曲霉菌提取液：100mmol/L KCL,20mmol/lTris-HCL(PH8.3),5mmol/L Mgcl2，0.2g/L 明 膠 ，0.9%吐溫20。煙曲霉、黃曲霉等臨床常見曲霉菌感染菌，選取保守區(qū)域設(shè)計LAMP引物，外引物為F3和B3,內(nèi)引物為FIP和BIP。序列分別為F3（5＇-GAGGATGCTTCGGGTGC-3＇）,B3 （5＇-CTCTACTTG TGCGCTATCGG-3＇）,FIP(5＇-ACCCCATCCCAGAC GGGATTCTGTCTAAGTGCCCTGGAAC-3＇),BIP(B1 C-B2)(5＇-TTCGACGAGTCGAGTTGTTTGGGTCTCCGGCCAGTATTTAGCT-3＇)由上海生工生物工程有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 純菌DNA提取 曲霉菌DNA提取參照文獻(xiàn)[3-5],將沙保平板純菌落用無菌水洗滌，15000r/min離心5min,取200mg左右濕潤菌落加100μl曲霉菌提取緩沖液，50μl溶細(xì)胞酶，37℃1h,再加入100μg蛋白質(zhì)酶K，55℃ 1h,然后95℃滅活10min,最后15000r/min，4℃離心10min。上清液即為核酸擴(kuò)增模板。

1.2.2 臨床標(biāo)本處理 痰液標(biāo)本加入1~3倍痰液體積的胰蛋白酶（0.25%），置37℃水浴1h，2000r/min離心 3min,取上清夜 1ml，15000r/min 離心 5min，棄上清,在沉淀中加入100μl曲霉菌提取緩沖液，制成懸液，再按上述純菌DNA提取方法操作。

1.2.3 LAMP檢測 LAMP反應(yīng)條件按照試劑盒說明書操作。LAMP反應(yīng)體系：1.6μmol/l的引物FIP和 BIP，0.2μmol/l引物 F3 和 B3，1X LAMP 反應(yīng)緩沖液 12.5μl，8U BstDNA 酶 1μl,熒光染料 1μl，2.5μl DNA 模板，純水至 25μl。 64℃恒溫 1.5h，最后80℃5min滅活，BstDNA酶終止反應(yīng)。模板先進(jìn)行95℃ 4min,然后冰上冷卻處理，再加入2.5μl于上述反應(yīng)體中，最后以肉眼觀察顏色變化。

1.2.4 PCR檢測 PCR反應(yīng)體積為25ul，分別以兩條 引 物 F3 （5＇-GAGGATGCTTCGGGTGC-3＇）,B3（5＇CTCTACTTGTGGGCTATCGG-3＇）。 其中引物各0.4umol/l，PCR 緩沖液 12.5μl,DNA 模板 2.5μl，超純水至 25μl。 94℃預(yù)變性 5min，94℃ 30s， 退火55℃30s，72℃延伸 30s，共 30 個循環(huán)，最后 72℃延伸10min產(chǎn)物在含熒光染料的1.5%瓊脂糖電泳，用凝膠成像系統(tǒng)觀察結(jié)果。

1.2.5 敏感性試驗 煙曲霉菌株按上述方法提取DNA 模板，純化，制備系列分別含 100、50、5、0.5、0.05pg模板進(jìn)行LAMP和PCR檢測。

1.2.6 特異性實驗 將煙曲霉菌、黃曲霉菌及各對照菌提取DNA分別進(jìn)行LAMP擴(kuò)增,觀察特異性。

2 結(jié)果

2.1 特異性試驗 LAMP法對煙曲霉、黃曲霉菌擴(kuò)增后，呈現(xiàn)典型的梯型條帶，肉眼觀察，陽性擴(kuò)增小管中呈現(xiàn)綠色混濁，而其他非曲霉菌，均未擴(kuò)增出產(chǎn)物，肉眼觀察小管呈陰性為橙紅色,見圖1、圖2和表1。

2.2 敏感性試驗 LAMP法檢測煙曲霉菌最低濃度在0.05pg，PCR法檢測則最低濃度為0.5pg,LAMP法比PCR法敏感性高10倍。在最低檢測濃度時也能進(jìn)行肉眼直接觀察，見圖3和表2。

圖1 LAMP反應(yīng)檢出結(jié)果

圖2 LAMP特異性檢測結(jié)果

表1 LAMP擴(kuò)增特異性試驗檢測結(jié)果

圖3 煙曲霉菌LAMP法與PCR法敏感性檢測結(jié)果比較

表2 LAMP法和PCR法敏感性的比較

2.3 臨床標(biāo)本檢測 經(jīng)涂片鏡檢、分離培養(yǎng)和PCR檢測確診的10例臨床痰液標(biāo)本,經(jīng)處理和提取DNA，經(jīng)LAMP擴(kuò)增后，均為陽性。

3 討論

LAMP技術(shù)是Notomi[6]等提出的一種新的核酸擴(kuò)增技術(shù)，由于采取了2對引物來識別目標(biāo)基因6個不同區(qū)段,而具有高度特異性,只需將反應(yīng)混合液在恒溫65℃條件下保持1h左右。反應(yīng)過程快捷,檢測結(jié)果直觀可見,檢測靈敏度比PCR方法高[7]。

侵襲性曲霉病是發(fā)生在免疫力低下人群中的一種機(jī)會性致病菌感染，IA）發(fā)生率逐年增加。此病進(jìn)展快，早期診斷困難，病死率高，其死亡率在部分患者中可達(dá)70%～90%[8,9],其早基因診斷是抗菌治療的關(guān)鍵，該病的臨床癥狀不特異,影像學(xué)檢查缺乏特異性，實驗室診斷方法主要是分離培養(yǎng)，其培養(yǎng)陽性率低且耗時長。而分子生物學(xué)方法是曲霉菌感染診斷中最具有應(yīng)用前景的一種方法[10]。

本研究采用LAMP技術(shù)應(yīng)用于曲霉菌的診斷、簡便快速。通過梯度稀釋方法進(jìn)行敏感性試驗,發(fā)現(xiàn)LAMP和PCR檢測最低濃度分別為0.05pg和0.5pg,相差10倍，與相關(guān)報道相似[5,11]，比PCR法有更高的敏感性。除曲霉菌陽性外，其余對照菌株均為陰性，特異性好。在10例確診臨床痰液標(biāo)本檢測中均為陽性。分子生物學(xué)方法，LAMP方法與傳統(tǒng)PCR法相比，有著操作簡單、經(jīng)濟(jì)、快速、敏感性和特異性好等特點[12-15],值得在臨床推廣應(yīng)用。