慢性乙型肝炎患者HBV基因分型和耐藥突變的分析

李雯 ，賴啟南 ，張志成 *，李煒 ，陳勇平 ，肖影群

（1.南昌市第九醫院，江西 南昌 330002；2.寧都縣人民醫院，江西 寧都 342800；3.宜黃縣人民醫院，江西 宜黃 344400）

全球估計有2.4億人感染乙型肝炎病毒，這些感染者患肝硬化和肝細胞癌(HCC)的風險明顯增加[1]。據統計，目前我國有慢性HBV感染者約9300萬人，慢性HBV感染可引起慢性乙型肝炎、肝硬化、肝衰竭和肝細胞癌[2]，我國肝硬化和HCC患者中，分別有60%和80%的比例是由HBV感染引起的[3]。因此，HBV感染已成為我國嚴重的公共衛生問題之一，長期威脅著我國人民的健康，同時造成嚴重的經濟負擔。

目前，臨床上應用于抗HBV治療的主要藥物是核苷（酸）類似物（nucleoside analogues，NAs），我國主要使用的抗HBV治療的NAs為拉米夫定（LAM）、阿德福韋酯（ADV）、替比夫定（LdT）、恩替卡韋（ETV）與替諾福韋酯（TDF）。NAs因抗病毒作用強、口服方便、不良反應小、價格相對易接受等優點在臨床上應用廣泛[4]，但是NAs的治療缺點是停藥難，需長期用藥,隨著NAs的廣泛和長期應用,在治療的過程中患者很容易發生HBV耐藥突變[5]。因此,及時了解患者的耐藥情況,可以更好的指導臨床用藥,幫助患者制定最佳的抗病毒治療方案。

本文通過回顧性分析江西地區542例慢性乙肝患者的HBV基因分型和耐藥相關位點突變的情況，為臨床制定抗病毒治療方案提供參考依據，幫助降低疾病進展風險。

1 資料與方法

1.1 一般資料 納入2017年7月-2019年6月在我院進行HBV耐藥檢測和基因分析的542例慢性乙肝患者，其中男459例，女83例；年齡23～78歲，中位數年齡51歲。所有患者診斷均符合中華醫學會肝病學分會、中華醫學會感染病學分會2015年修訂的《慢性乙型肝炎防治指南》標準[4]，并且均排除有HIV，HAV，HCV，HDV共同感染以及免疫功能不全者。

1.2 儀器與試劑 病毒核酸提取純化試劑盒，乙型肝炎病毒分型及耐藥突變基因檢測試劑盒，PCR擴增儀（ABI 7500），PCR分子恒溫雜交儀（深圳亞能 YN-H16）。

1.3 方法

1.3.1 HBV DNA的提取 收集患者空腹靜脈血5 ml，常溫放置30 min，離心后取血清，-20℃保存備用。1.5ml離心管中先后加入HBV DNA提取液I和樣品（待檢血清或陰/陽質控品）各200uμl，振蕩混勻，13000r/min離心 5min， 棄上清,加入 50μl HBV DNA提取液II，混合均勻至沉淀完全溶解，低速離心數秒后，100℃干浴或沸水浴 10min；2000r/min離心數秒，加入5μl三氯甲烷，振蕩混勻，13000r/min離心5min；取上清3μl作為PCR反應模板。

1.3.2 PCR擴增 取出PCR反應管稍事離心，并在管蓋上做好標記,加入3μl已提取的待測樣本DNA，陰性質控及陽性質控同樣處理。反應程序：50℃ 2min；95℃10min；94℃ 60s，68℃ 90s，30 個循環 ；94℃ 30s，54℃30s，72℃ 30s，30 個 循 環 ；72℃5min。

1.3.3 雜交 取15ml離心管，放入HBV基因分型及耐藥突變檢測膜條，然后加入5ml左右的A液，再加入25μlPCR擴增產物，100℃沸水浴中加熱10min，取出離心管，放入雜交箱47℃雜交90min。

1.3.4 洗膜和顯色 將雜交好的膜條轉移至裝有40ml B液（47℃預先預熱好）的50ml離心管中輕搖15min。然后取出膜條放入孵育液（按A液/POD=2000/1的比例配置），室溫輕搖孵育30min。棄孵育液，用A液室溫搖洗2~3次，每次 5min。再用C液室溫洗膜2min。再將膜條浸泡于顯色液(10張膜體系：19mlC 液+1mlTMB+2μl30%H2O2)中避光顯色10-15min，并用純水終止顯色反應。

1.4 統計學方法 采用SPSS 21.0統計軟件對數據進行處理，計數資料組間比較采用χ2檢驗,以 P＜0.05為差異有統計學意義；計數資料以n(%)表示。

2 結果

2.1 結果判讀 乙型肝炎病毒患者的血清經過HBV DNA的提取，PCR擴增以及與膜條的雜交、顯色等過程后,可通過膜條各陣列的顯色情況(藍色斑點)直接判讀HBV的耐藥情況及其基因型,見圖1。當膜條各陣列只有CC位點顯色而其他位點不顯色，則表明被檢樣本中的HBV病毒量低于本試劑的最低檢測下限或者樣本中不存在HBV。

2.2 HBV基因分型 經分型鑒定顯示，542例CHB中共檢出B、C、BC、BD及其他型等五種基因型,主要基因型為B型和C型,其中B基因型比例最大(83.0%，450/542),C 基因型次之(12.6%，68/542)。 此外,542例樣本中共檢測到耐藥突變184例，耐藥檢出率為33.9%(184/542),并且耐藥突變中以B、C 2種基因型為主體,其中B基因型151例,耐藥檢出率為33.6%（151/450），C基因型22例,耐藥檢出率為 32.4%（22/68），B、C基因型在耐藥檢出率方面無統計學差異（P>0.05）。具體情況見表1。

圖1 HBV耐藥測定及基因分型膜條示意圖

表1 HBV基因分型結果

2.3 NAs藥物的耐藥情況 542例樣本中共檢測到耐藥突變184例，耐藥檢出率為33.9%（184/542）；其中，出現突變的184例樣本中LAM耐藥例數為152（82.6%），LdT 耐藥例數為 151（82.1%）,ADV 耐藥例數為 50（27.2%），ETV耐藥例數為 27（14.6%）,并且有 152（82.6%）例出現了多種藥物耐藥的情況。見表2。

2.4 HBV耐藥突變位點分析 在184例發生耐藥突變的樣本中，共發現了20種不同的耐藥突變模式，其中發生單個位點突變111例（60.3%），發生多個位點突變73例（39.7%）；單個位點以 rt204 I/V位點的突變檢出率最高（33.7%，62/184），多個位點以rt204 I/V+rt180 M的突變檢出率最高（22.3%，41/184）。見表3。對總的突變檢出率進行分析顯示,突變檢出率最高的位點為 rt204 I/V（70.7%,130/184）,其次為 rt180 M（34.8%,64/184）,再次為 rt236 T（19.6%，36/184）。 見表 4。

表2 HBV耐藥株分布情況[n(%)]

3 討論

隨著核苷酸類抗病毒藥物的普及和用藥時間延長，HBV耐藥株帶來的問題已經嚴重損害了CHB的健康,因此及時高效的檢測出患者在治療過程中是否出現了耐藥顯得尤為重要。檢測乙肝耐藥突變的方法有限制性片段長度多態性法、多溫度單鏈構象多態性法、直接測序法和克隆測序法、線性探針分析法、基因芯片技術和核酸質譜檢測技術等,其中基因芯片技術和Sanger測序法是目前運用最為廣泛的兩種技術[6]。

表3 HBV耐藥位點分布情況[n(%)]

表4 HBV耐藥位點分布情況[n(%)]

本研究采用PCR-反向點雜交基因芯片技術對來自江西地區542例CHB的基因型及其耐藥突變情況進行檢測。基因分型的結果顯示江西地區HBV 分型主要以 B（83.0%）、C（12.6%）基因型為主，檢測結果符合南方以B基因為主的結論，并且與本地區其他研究結果相吻合[7，8]；其中，B基因型的耐藥檢出率為33.6%（151/450）,C基因型的耐藥檢出率為 32.4%（22/68）；但是，B、C 基因型在耐藥檢出率方面差異無統計學意義（P＞0.05）。此外，本研究還檢測到BC混合型13例，BD混合型8例以及其他型3例,同時本研究發現混合型發生耐藥的概率明顯高于其他基因型,但是因為混合型基因型的樣本量比較少,所以混合基因型是否與耐藥突變存在關系還需進一步擴大樣本量證實。

目前，臨床上用于抗乙型肝炎病毒的NAs主要是拉米夫定、替比夫定、阿德福韋酯、恩替卡韋和替諾福韋酯等幾種藥物，CHB患者在使用替諾福韋酯抗病毒治療時病毒學應答率良好，8年隨訪研究暫未發現TDF相關耐藥[9]。故而，本研究主要是針對前4中NAs藥物進行突變位點的檢測，檢測的拉米夫定突變位點為rt204 I/V+rt180 M、rt204 I/V、rt181 V/T和rt207 I,替比夫定突變位點為rt20 4 I/V+rt180 M、rt204 I和 rt181 V/T，阿德福韋酯突變位點為rt181 V/T和rt236 I，恩替卡韋突變位點為rt204 I/V+rt180 M或rt204 I/V加rt184 I/S/A/F/L、rt250 I/L/V、rt202 G/I任意位點。

本文結果顯示542例樣本中有184例發生了不同程度的耐藥位點突變,突變檢出率為33.9%，該結果與滕菁等[10]（161/433，37.2%）和郭耿龍等[11]（67/182，36.8%）的研究結果相符；但是低于馬軍等[12](1193/2765，43.15%)和韓宇等[13]（46.87%，75/160）的研究結果；此外本研究結果又顯著高于李少燕等[14]（30/255，11.8%）和許桂丹等[15]（63/869，7.25%）的結果。究其原因，可能與耐藥基因屏障、突變對病毒適應力的影響、患者用藥的規范性和用藥史、地域不同等多種因素相關。

突變位點結果分析顯示，共發現了20種不同的耐藥突變模式，以 rt204 I/V（33.7%，62/184）單一位點突變和rt204 I/V+rt180 M(22.3%，41/184)聯合位點突變為主，這兩個突變均提示LAM和LdT聯合耐藥。有48（26.1%，48/184）例患者在rt236 T和rt181 V/T位點發生了突變,其中31例是rt236 T突變，該位點突變提示ADV耐藥，13例患者是rt181 V/T突變，4例是rt236 T＋rt181 V/T聯合突變，該17例患者提示發生了LAM、LdT和ADV聯合多重耐藥。ETV是高耐藥基因屏障藥物，除了預先存在的rt204 I/V+rt180 M或rt204 I/V耐藥位點，還需要同時出現rt184 I/S/A/F/L、rt250 I/L/V和rt202 G/I任意位點突變[1],本研究中ETV相關的rt184、rt2 50、rt202三個位點發生突變的患者為37例，其中3例患者為rt184單一位點突變，5例為rt250單一位點突變、2例為rt202單一位點突變,其余27（14.6%，27/184）例患者均為rt204 I/V+rt180 M或rt204 I/V突變模式的基礎上分別發生rt184、rt250、rt202任意位點的多重耐藥突變，因此，LAM耐藥的患者換用或加用 ETV治療時需定期監測療效，以防發生聯合多重耐藥。

本研究大樣本回顧性分析江西地區慢性乙型肝炎患者HBV基因分型與耐藥突變。提示江西地區NAs耐藥檢出率相對較高，且耐藥突變模式復雜多樣，有待深入研究，對患者在抗病毒治療過程中定期進行NAs耐藥檢測對制定用藥方案、提高抗HBV療效以及預防耐藥株的產生也具有重要的臨床價值。