γ干擾素釋放試驗(yàn)在HIV合并TB感染中的應(yīng)用價(jià)值

邊澤源，楊云紅，吳芝煒，張齊龍，熊玉紅

（江西省胸科醫(yī)院檢驗(yàn)科，江西 南昌 330006）

全球近3400萬(wàn)HIV感染者中，有超過(guò)1/3合并感染TB（包括潛伏感染），HIV合并TB感染者結(jié)核發(fā)病率是單純TB感染者的30倍[1]。數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)顯示，我國(guó)艾滋病患者中結(jié)核病的感染率達(dá)29.1%，結(jié)核病已經(jīng)成為艾滋病患者就診、入院和死亡的主要原因,嚴(yán)重影響到艾滋病患者的預(yù)后和生存質(zhì)量[2,3]。相比于非免疫缺陷者，HIV感染者更容易重新激活體內(nèi)潛伏性感染結(jié)核分枝桿菌并發(fā)展為彌漫性感染，病情迅速惡化甚至死亡[4,5]，因此早期診斷HIV合并TB感染、及時(shí)發(fā)現(xiàn)隱匿性TB，對(duì)控制HIV合并結(jié)核分枝桿菌感染、降低其住院率及病死率，具有重要意義。本研究回顧性分析四種TB診斷方法在HIV合并TB感染患者中的診斷價(jià)值，報(bào)告如下。

1 研究對(duì)象與方法

1.1 一般資料 收集2015年1月-2017年12月我院確診HIV合并TB感染的患者資料40例，男31例，女9例；年齡44.95±13.18歲。同期HIV未合并TB感染的患者資料40例,男29例,女11例；年齡45.9±15.31歲。艾滋病診斷符合艾滋病診療指南(2011版)的診斷標(biāo)準(zhǔn)[6]。肺結(jié)核均依據(jù)臨床表現(xiàn)，細(xì)菌學(xué)，影像學(xué)或抗結(jié)核藥物治療確診，診斷依據(jù)按照2005年中華醫(yī)學(xué)會(huì)《臨床診療手冊(cè)（結(jié)核病分冊(cè)）》診斷標(biāo)準(zhǔn)[7]。

1.2 主要儀器與試劑 γ干擾素釋放試劑盒 （英國(guó)Oxford Immunotec Ltd.），人型結(jié)核菌素純蛋白衍生物試劑(Purified protein derivative，PPD)（北京祥瑞生物制品有限公司），結(jié)核分枝桿菌抗體檢測(cè)試劑盒（成都永安制藥有限公司）

1.3 方法

1.3.1 γ干擾素釋放試驗(yàn) 采血前囑咐患者空腹8h以上，以含抗凝劑檸檬酸鈉的采血管采集肘靜脈血10ml，盡快分離單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)，用細(xì)胞培養(yǎng)液重懸細(xì)胞備用。將包被抗IFN-7抗體的微量板平衡至室溫,向4個(gè)孔中分別加入結(jié)核分枝桿菌特異混合多肽 A（含 ESAT-6）和 B（含 CFP-10），陰性對(duì)照細(xì)胞培養(yǎng)液，陽(yáng)性對(duì)照植物血凝素(PHA)。然后，各孔分別加入含250 000個(gè)細(xì)胞的上述單個(gè)核細(xì)胞懸液。37℃培養(yǎng)16～20 h后，用PBS液洗板4次，各孔分別加入堿性磷酸酶標(biāo)記的小鼠抗人IFN單抗，2～8℃孵育1 h。取出后用PBS液洗板4次。各孔分別加入顯色底物液BCIP／NBTPLUS，室溫中靜置7 min后觀察結(jié)果。當(dāng)測(cè)試孔A或B達(dá)到以下標(biāo)準(zhǔn)則判定為陽(yáng)性結(jié)果：⑴如果陰性對(duì)照孔斑點(diǎn)數(shù)為0～5個(gè),測(cè)試孔斑點(diǎn)數(shù)減去陰性對(duì)照孔斑點(diǎn)數(shù)≥6。⑵如果陰性對(duì)照孔斑點(diǎn)數(shù)≥6個(gè)，測(cè)試孔斑點(diǎn)數(shù)必須≥2倍的陰性對(duì)照孔斑點(diǎn)數(shù)。注意：陽(yáng)性對(duì)照孔不出現(xiàn)斑點(diǎn)，說(shuō)明試驗(yàn)不成功。

1.3.2 痰涂片找抗酸菌檢測(cè) 抗酸染色鏡檢嚴(yán)格按照中國(guó)防癆協(xié)會(huì)制定的 《結(jié)核病診斷實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)規(guī)程》[8]進(jìn)行。

1.3.3 結(jié)核分支桿菌素PPD 消毒皮膚，在左前臂背側(cè)上1/3處，皮內(nèi)注射5 U人型結(jié)核分支桿菌素純蛋白衍生物（Montous法，l：2 000)。 結(jié)果判斷按照《全國(guó)結(jié)核病防治工作手冊(cè)》規(guī)定標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行：在試驗(yàn)72 h后，硬結(jié)平均直徑=(橫徑+縱徑)/2。硬結(jié)直徑≥5個(gè)者或有水皰、破潰者為PPD試驗(yàn)陽(yáng)性。無(wú)紅腫硬結(jié)者為陰性。

1.3.4 血清結(jié)核抗體檢測(cè) 采用結(jié)核分枝桿菌抗體檢測(cè)試劑盒進(jìn)行分析,具體步驟及判斷方法嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。

1.4 統(tǒng)汁方法 檢測(cè)結(jié)果均用陽(yáng)性率表示,運(yùn)用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件,采用配對(duì)χ2檢驗(yàn)對(duì)各組陽(yáng)性檢出率進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 四種檢測(cè)方法在HIV合并TB患者中陽(yáng)性檢出率的比較 40例HIV合并TB感染患者，γ干擾素釋放試驗(yàn)診斷HIV合并TB感染敏感性為65.0%（26/40）、特異性為97.5%，其敏感性顯著優(yōu)于痰找抗酸桿菌 17.0%（7/40），PPD 15%(6/40)和結(jié)核抗體40.0%(16/40)(P＜0.05)。且γ干擾素釋放試驗(yàn)在免疫嚴(yán)重抑制（CD4＜100/mm3）患者中敏感性＞60.0%。40例HIV未合并TB感染患者，γ干擾素釋放試驗(yàn)假陽(yáng)性2.5%(1/40)，而結(jié)核抗體假陽(yáng)性率為 32.5%(13/40)。

2.2 CD4細(xì)胞計(jì)數(shù)水平對(duì)4種試驗(yàn)陽(yáng)性檢出率比較 按CD4細(xì)胞計(jì)數(shù)水平高低分為CD4＜100/m m3(17 例)，CD4(101～200)/mm3(15 例),CD4(201～500)/mm3(8 例)，CD4＞500/mm3(0 例)。γ 干擾素釋放試驗(yàn)在各組陽(yáng)性檢測(cè)率均高于其余3種試驗(yàn)，且在免疫不同組中檢測(cè)陽(yáng)性率無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。見(jiàn)表1。

表1 CD4細(xì)胞計(jì)數(shù)水平對(duì)4種試驗(yàn)陽(yáng)性檢出率的影響

3 討論

HIV合并肺結(jié)核分枝桿菌感染初期，臨床癥狀不典型，肺部影像學(xué)也難以判斷，傳統(tǒng)的痰涂片找抗酸桿菌和痰結(jié)核菌培養(yǎng)，仍是TB感染診斷的金標(biāo)準(zhǔn)，但涂片陽(yáng)性率低，培養(yǎng)時(shí)間亦長(zhǎng)，給結(jié)核病的早期診斷與治療帶來(lái)困難。γ干擾素釋放試驗(yàn)（TB-interferon gamma release assay,TB-IGRA)是一種體外檢測(cè)TB致敏T淋巴細(xì)胞的結(jié)核感染診斷方法。該方法利用結(jié)核分枝桿菌特異性抗原作為刺激物，結(jié)合酶聯(lián)免疫技術(shù)的放大優(yōu)勢(shì),研究報(bào)道對(duì)潛伏性TB感染的診斷具有較高的敏感性和特異性[9,10]。

本研究采用4種實(shí)驗(yàn)對(duì)HIV合并TB感染患者進(jìn)行檢測(cè)分析，結(jié)果顯示，TB-IGRA實(shí)驗(yàn)的陽(yáng)性率為65.0%，與李春夢(mèng)等[11]報(bào)道的基本一致，明顯高于PPD試驗(yàn)、結(jié)核抗體及痰涂片檢測(cè)結(jié)果。且在CD4細(xì)胞不同組陽(yáng)性檢測(cè)率均高于其余3種方法，即使在免疫嚴(yán)重受抑制的患者中TB-IGRA檢測(cè)陽(yáng)性率也達(dá)到60.0%。比較顯示,傳統(tǒng)的痰找抗酸桿菌、PPD試驗(yàn)和結(jié)核抗體等方法在檢測(cè)HIV感染合并TB中均存在不同的局限性。尤其值得一提的是，由于我國(guó)大面積接種卡介苗，導(dǎo)致 PPD試驗(yàn)存在假陽(yáng)性，且對(duì)于HIV感染合并TB患者屬于免疫低下人群，也存在一定的假陰性率[12]。有研究表明HIV感染后細(xì)胞免疫應(yīng)答和變態(tài)反應(yīng)受到抑制，PPD試驗(yàn)的陽(yáng)性檢出率降低至15%～40%[13]。結(jié)核抗體常規(guī)檢測(cè)方法較復(fù)雜,并且也受到患者免疫力及抗原特異性的影響，對(duì)HIV合并TB患者診斷意義有限。痰涂片作為HIV合并肺結(jié)核分枝桿菌感染診斷和療效觀察最直接、簡(jiǎn)便的檢驗(yàn)方法，但其受標(biāo)本質(zhì)量，檢驗(yàn)人員主觀影響大，漏檢率較高。劉艷等[14]報(bào)道，對(duì)HIV疑似感染分枝桿菌患者標(biāo)本139人份標(biāo)本進(jìn)行直接涂片檢到的抗酸分枝桿菌僅9例；TB-IGRA主要檢測(cè)TB患者體內(nèi)存在特異的效應(yīng)T淋巴細(xì)胞。當(dāng)這部分T淋巴細(xì)胞在體外再次受到結(jié)核桿菌特異抗原(ESAT-6與CF P-10)的刺激時(shí)，會(huì)分泌釋放 IFN-γ，因此，通過(guò)檢測(cè)IFN-γ的水平可以判斷機(jī)體是否存在結(jié)核感染[15]。雖然在HIV感染后導(dǎo)致 CD4+T細(xì)胞下降，但是 CD8+T細(xì)胞和 γδ+T細(xì)胞也可以少量分泌IFN-γ，所以即使免疫嚴(yán)重受抑制，仍不受影響。

綜上所述,TB-IGRA方法,由于其對(duì)結(jié)核診斷的高敏感性和高特異性，且不易受患者免疫狀態(tài)的影響，很受臨床醫(yī)生的青睞，短短幾年，已在臨床得到廣泛應(yīng)用，已成為臨床診斷結(jié)核的常規(guī)檢測(cè)方法。本文結(jié)果也顯示，TB-IGRA方法對(duì)早期診斷HIV患者合并TB感染明顯優(yōu)異傳統(tǒng)的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)方法。