重組脂聯(lián)素對自然流產(chǎn)模型小鼠妊娠結局及Th17/Treg 平衡的影響

喬小改

（鄭州大學第二附屬醫(yī)院產(chǎn)科，河南 鄭州 450000）

正常妊娠為一種成功的半同種異體移植現(xiàn)象，其前提是母胎之間正常的免疫耐受，這種耐受過程存在復雜精細的免疫調節(jié)，其中有多種諸如輔助性T細胞17(T helper cell17，Th17)和CD4+CD25+調節(jié)性 T 細胞（regulatory T cell，Treg）的免疫細胞參與[1,2]。近年來多篇文獻報道[3,4]不明原因復發(fā)性流產(chǎn)（unexplained recurrent spontaneous abortion，URSA)與Th17/Treg失衡密切相關。脂聯(lián)素（adiponectin，APN）是一類由脂肪細胞分泌的激素蛋白，不僅參與非胰島素依賴型糖尿病 （non-insulin dependent diabetes，NIDD）、 冠狀動脈粥樣硬化性心臟病（coronary atherosclerotic heart disease，CAHD）的發(fā)展,也與妊娠糖尿病、妊娠特發(fā)性脂肪肝、先兆子癇等妊娠并發(fā)癥的發(fā)生有一定關聯(lián)。相關研究發(fā)現(xiàn)[5]APN受體在試管嬰兒反復胚胎種植失敗者中呈低表達,提示APN信號缺乏可能導致妊娠失敗。Ramezani A等[6]的課題研究發(fā)現(xiàn)APN體外處理可改善自然流產(chǎn)者外周血單個核細胞（peripheral blood mononuclear cell，PBMC）的 Th17/Treg失衡。但目前尚未見到APN對自然流產(chǎn)模型小鼠妊娠結局及Th17/Treg失衡影響的相關研究報道,故本研究欲通過觀察APN對自然流產(chǎn)模型小鼠妊娠結局及Th17/Treg細胞分群的影響,為自然流產(chǎn)防治措施的研究提供參考,現(xiàn)將研究結果報告如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 經(jīng)動物保護協(xié)會及醫(yī)學倫理委員會批準,選用購于上海南方模式生物科技股份有限公司,許可證號：SCXK（滬）2017-0010的 8~10周齡健康SPF級雄性BALB/c小鼠、雄性DBA/2小鼠、雌性CBA/J小鼠，平均體質量約25g。小鼠分籠飼養(yǎng)于動物實驗室獨立通氣籠中,實驗室室溫維持在22~25℃，濕度維持在50%~60%，采用同種無菌飼料對所有小鼠進行投喂，不限制飲水，每天光照12h，適應性喂養(yǎng)1周。

1.2 實驗試劑 小鼠脂聯(lián)素、轉化生長因子β（Transforming growth factor β，TGF-β）、白細胞介素 17（Interleukin17，IL-17）酶聯(lián)免疫吸附試劑盒購于美國TSZ;生理鹽水購于上海喬羽生物科技有限公司；脂聯(lián)素重組蛋白購于美國Amresco；PBS緩沖液購于常德比克曼生物科技有限公司；FITC-CD25單克隆抗體購于廣州健侖生物科技有限公司；FITC-IL-17A單克隆抗體購于美國eBioscience；布雷菲德菌素A（BFA）購于湖北欣欣佳麗生物科技有限公司；PE-Cy7-CD4單克隆抗體購于上海瑞齊生物科技有限公司；PE-FoxP3單克隆抗體購于上海微蒙生物公司；佛波酯（PMA）購于南京春秋生物工程有限公司；伊諾霉素（ionomycin）購于美國Sigma。

1.3 小鼠模型及給藥方式 適應性喂養(yǎng)1周后，將雌性CBA/J小鼠與雄性BALB/c小鼠合籠交配建立正常妊娠（Normal pregnancy，NP）模型（n=10），雌性CBA/J小鼠與雄性DBA/2小鼠合籠交配建立自然流產(chǎn)（spontaneous abortion，SA）模型（n=20），各小鼠合籠后，觀察陰栓，若發(fā)現(xiàn)陰栓則計為妊娠第0日，將雌性CBA/J小鼠與雄性BALB/c小鼠、雄性DBA/2小鼠隔離飼養(yǎng)。將20只SA模型小鼠采用隨機數(shù)字列表法分為脂聯(lián)素組 （APN組，n=10）和生理鹽水組（NS 組，n=10），妊娠第 5d，APN組 CBA/J孕鼠腹腔注射 10μg/（kg·d）重組脂聯(lián)素，1次/d，NP組和NS組CBA/J孕鼠腹腔注射等量生理鹽水。3組療程均為9 d。

1.4 評價指標

⑴脂聯(lián)素、IL-17、TGF-β 水平：CBA/J孕鼠眼球取血，2 419×g離心10 min，分離血清，采用酶聯(lián)免疫吸附法 (ELISA)檢測CBA/J孕鼠血清中脂聯(lián)素、IL-17、TGF-β、IL-17/TGF-β 水平。

⑵胚胎吸收率：療程結束,將CBA/J孕鼠處死，無菌狀態(tài)下打開腹腔，切開子宮，分離胚胎、胎盤等，將其與正常胚胎作比較，觀察胚胎大小、出血情況、吸收情況等，計數(shù)存活胚胎數(shù)和吸收胚胎數(shù)，計算胚胎吸收率。胚胎吸收率=吸收胚胎數(shù)/總胚胎數(shù)×100%。

⑶脾臟淋巴細胞中Th17、Treg比例：療程結束,將CBA/J孕鼠處死，無菌狀態(tài)下打開腹腔，分離CBA/J孕鼠脾臟，充分剪碎，制成勻漿液，用200目不銹鋼濾網(wǎng)過濾，分離獲得小鼠脾臟淋巴細胞，調整細胞懸液濃度為1×107/ml。取小鼠脾臟淋巴細胞懸液 200μl， 加入 0.05ng/L PGMEA、10 ng/L BFA、1mol/L伊諾霉素37℃孵育5 h，PBS漂洗，加入10μl PE-Cy7-CD4抗體，4℃避光孵育 0.5h，PBS漂洗，再加入10μl FITC-IL-17A抗體，4℃避光孵育0.5h，PBS緩沖液重懸細胞，采用流式細胞儀（美國貝克曼庫爾特，型號：CytoFLEX LX）檢測CD4+IL-17A+細胞占CD4+T淋巴細胞的比例。同上，取小鼠脾臟淋巴細胞懸液200μl，加入10μl FITCCD25抗體、10μl PE-Cy7-CD4抗體，4℃避光孵育0.5h，PBS漂洗，加入PE-FoxP3抗體，4℃避光孵育0.5h，PBS緩沖液重懸細胞，采用流式細胞儀檢測CD4+CD25+FoxP3+細胞占CD4+T淋巴細胞的比例。

1.5 統(tǒng)計學處理 采用spss22.0軟件進行統(tǒng)計分析。計量資料多組間比較采用單因素方差分析，其中兩兩比較采用SNK-q檢驗；計數(shù)資料比較采用卡方檢驗。P<0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 各組孕鼠妊娠結局 與NP組比較，NS組胚胎吸收率明顯升高（P<0.05）；與NS組比較，APN組胚胎吸收率明顯下降（P<0.05）；NP組、APN組胚胎吸收率相比,差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）,見表 1。

表1 各組孕鼠胚胎吸收情況比較[n(%)]

2.2 各組孕鼠血清中脂聯(lián)素、IL-17、TGF-β、IL-17/TGF-β水平 與NP組比較，NS組血清中脂聯(lián)素、TGF-β 水平明顯下降（P<0.05），IL-17、IL-17/TGF-β水平明顯升高（P<0.05）；與NS組比較，APN組血清中脂聯(lián)素、TGF-β水平明顯升高（P<0.05），IL-17、IL-17/TGF-β 水平明顯下降 （P<0.05）；NP 組、APN 組血清中脂聯(lián)素、IL-17、TGF-β、IL-17/TGF-β 水平相比，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）,見表 2。

2.3 各組孕鼠脾臟淋巴細胞中Th17、Treg細胞分群 與NP組比較，NS組Th17/CD4+T細胞比例、Th17/Treg比值明顯升高 （P<0.05），Treg/CD4+T細胞比例明顯下降（P<0.05）；與NS組比較，APN組Th17/CD4+T細胞比例、Th17/Treg比值明顯下降（P<0.05）,Treg/CD4+T 細胞比例明顯升高(P<0.05)；NP組、APN組Th17/CD4+T細胞比例、Th17/Treg比值、Treg/CD4+T細胞比例相比,差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）,見表 3。

表3 各組孕鼠脾臟淋巴細胞中Th17、Treg細胞分群比較（)

表3 各組孕鼠脾臟淋巴細胞中Th17、Treg細胞分群比較（)

與NP組比較,*P<0.05；與APN組比較,#P<0.05

組別 例數(shù)(只)NP組NS組APN組10 10 10 FP Th17/CD4+T細胞Treg/CD4+T細胞1.80±0.75 5.70±1.30*#2.05±0.90 46.687<0.001 6.59±1.51 3.79±0.40*#6.30±1.05 20.078<0.001 Th17/Treg 0.30±0.09 1.51±0.29*#0.33±0.25 92.351<0.001

3 討論

成功妊娠實際是成功的母胎免疫耐受，這種耐受過程中若出現(xiàn)Th17/Treg失衡，則容易發(fā)生復發(fā)性流產(chǎn)（recurrent spontaneous abortion，RSA）[3,4]。RSA是指反復的自發(fā)性流產(chǎn)，為妊娠期常見并發(fā)癥，約占妊娠人群的30%。現(xiàn)有的檢查手段能明確的病因包括內分泌異常、父母染色體異常（如平衡易位攜帶者）、母體子宮結構異常、自身免疫異常（如抗磷脂抗體綜合征），但仍存在40%RSA人群不能明確病因則定義為URSA。由于URSA病因不明，臨床對URSA干預的針對性欠佳，使其成為生殖領域的難點。多位學者[7,8]就URSA的治療進行研究發(fā)現(xiàn)利用第三方的淋巴細胞進行免疫治療或靜脈注射免疫球蛋白（Immunoglobulin，Ig）等療效一般，安全性也有待證實。因此，尋找有效治療方案對存在免疫耐受失敗風險人群有重要意義。

表2 各組孕鼠血清中脂聯(lián)素、IL-17、TGF-β、IL-17/TGF-β水平比較（)

表2 各組孕鼠血清中脂聯(lián)素、IL-17、TGF-β、IL-17/TGF-β水平比較（)

與NP組比較,*P<0.05；與APN組比較,#P<0.05

組別 例數(shù)(只)NP組NS組APN組10 10 10 FP脂聯(lián)素（ng/ml）12.79±0.58 3.38±0.19*#11.92±1.05 549.951<0.001 IL-17（pg/ml）33.62±2.49 137.49±11.29*#48.20±6.69 531.726<0.001 TGF-β（pg/ml）72.42±2.09 32.31±5.50*#68.28±7.29 166.348<0.001 IL-17/TGF-β 0.48±0.13 4.27±0.07*#0.69±0.3 1217.560<0.001

白色脂肪組織可分泌抵抗素、瘦素(leptin，LEP)、血管緊張素（Angiotensin）、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、APN 等多種蛋白質，APN為脂肪細胞分泌的蛋白質中較為重要的一種[9]，其可參與整個妊娠過程，還能調控炎癥反應,并涉及對IG、細胞因子（如細胞刺激因子、白細胞介素、干擾素）、補體、人類白細胞抗原（Human leukocyte antigen,HLA）等免疫分子表達的影響[10]。相關文獻報道[11,12]APN還可調節(jié)Th17/Treg,在NID D、CAHD等疾病發(fā)生、發(fā)展過程中扮演重要角色。Zhu L等[13]發(fā)現(xiàn)正常妊娠者血清中APN水平明顯高于RSA患者,提示APN水平與妊娠結局（如URSA、胎兒早產(chǎn)或出生缺陷）密切相關。Wei-Hong L I等[14]進行體外試驗發(fā)現(xiàn)APN處理后URSA患者PBMC中Th17比例減少,CD4+CD25+調節(jié)性 T細胞比例上升,使Th17/Treg趨于正常,說明APN在妊娠過程中對Th17/Treg平衡有一定影響，而母胎之間正常的免疫耐受往往存在免疫調節(jié),進一步提示APN可能可母胎免疫有關。CBA/J×DBA/2為經(jīng)典的SA動物模型，孕鼠對胚胎的雄性抗原識別異常，從而產(chǎn)生異常的免疫應答可能為SA發(fā)生的主要機制。本研究中，NS組胚胎吸收率與NP組比較明顯升高，APN組胚胎吸收率與NS組比較明顯下降，結果與Fei W U等[15]人的報道基本相符，提示APN可有效改善SA小鼠胚胎吸收情況，減少不良妊娠結局。Th17、Treg為兩類重要的免疫細胞。Th17細胞是一種具有很強的促炎癥作用的能夠分泌IL-17的T細胞亞群,可參與系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)、自身免疫性溶血性貧血（AHA）、多發(fā)性腦脊髓硬化癥（MS）等自身免疫性疾病發(fā)生、發(fā)展，且與不良妊娠結局有密切關系[16]。而Treg是一類重要的具有促進母胎耐受、維持正常妊娠作用的免疫抑制細胞。一直以來，Th17/Treg平衡是生殖免疫耐受領域的研究熱點,為了進一步探討APN對SA作用機制,本研究采用流式細胞術檢測重組脂聯(lián)素對CBA/J孕鼠脾臟淋巴細胞中Th17/Treg分群的影響，結果顯示，NS組Th17/CD4+T細胞比例、Th17/Treg比值較NP組明顯升高，Treg/CD4+T細胞比例較NP組明顯下降；APN組Th17/CD4+T細胞比例、Th17/Treg比值較 NS 組明顯下降 （P＜0.05），Treg/CD4+T細胞比例較NS組明顯升高。因此，我們推測重組脂聯(lián)素可能通過調控脾臟淋巴細胞中失衡，影響母體對父系抗原特異性免疫耐受，從而使SA模型小鼠不良妊娠結局得以顯著改善。

綜上,重組脂聯(lián)素治療可能通過糾正Th17/Treg細胞失衡及相關細胞因子水平，改善SA模型小鼠的妊娠結局。但本研究造模數(shù)較少，有待擴大樣本作進一步研究。