東莞地區人群ApoE 基因多態性及其與冠心病、高血壓的相關性分析

雷亞利，杜華，華仙麗，梁愛芬，隋洪

（東莞康華醫院檢驗科，廣東 東莞 523000）

載脂蛋白（ApoE）是人體脂質代謝的糖蛋白。載脂蛋白E由第112和158氨基酸位點核苷酸多態性形成不同的基因型別。載脂蛋白（ApoE）基因型別包括基因112TT+158CC型 （載脂蛋白 ε3/ε3型 ）、112TT+158TT 型 （載 脂 蛋 白 ε2/ε2 型 ）、112CC+158CC 型 （載脂蛋白 ε4/ε4 型）、112T/C+158CC 型 （載脂蛋白 ε3/ε4 型）、112TT+158T/C 型（載脂蛋白 ε2/ε3 型）、112T/C+158T/C （載脂蛋白ε2/ε4型）。不同的載脂蛋白基因型別在脂質代謝中有差異。研究顯示載脂蛋白ε4等位基因是高血壓和冠心病等腦血管疾病重要危險因素[1-3]。而不同型別的載脂蛋白E基因型別扮演著不同等級的危險因素，其中ε4等位基因遠遠高于ε3等位基因[3-4]。雖然載脂蛋白E基因是阿爾茨海默病（AD）重要的危險因素中得到較為廣泛的認可[5-7]，但在其它高血壓和心血管疾病的研究較少。因此，加強載脂蛋白E基因在其它脂質代謝類疾病的相關性研究是很有必要的。特別是隨著載脂蛋白E基因檢測方法多樣化和簡易化,載脂蛋白E檢測結果數據會進一步累積。通過對累積的大數據進行統計學分析,將在非傳染性慢病病人管理中提供更多有益的經驗。本文通過對東莞地區人群ApoE基因多態性的分析,探討了其與高血壓、冠心病的關系；驗證了ApoE基因多態性與罹患冠心病和高血壓的風險，現報告如下。

1 資料和方法

1.1 一般資料 選取2017年1月至2018年9月期間3249例來東莞康華醫院門診、住院就診者為研究對象，按照下列標準將人群分為五組。上述患者均簽署知情同意書。

1.2 研究對象分組 選取2017年1月至2018年9月期間3249例來東莞康華醫院門診、住院患者為整體人群。其中整體人群的年齡范圍16~97歲；男性人群2189例，女性人群1060例。體檢中心人群不存在高血壓或是冠心病的人群為正常對照組。上述組別在年齡性別分布上面差別無統計學意義。患者均簽署知情同意書。其中高血壓患者636例、冠心病患者457例及高血壓合并冠心病患者258例，依據嚴格的臨床診斷標準確認。

1.3 試劑和儀器 使用珠海賽樂奇生物技術股份有限公司（注冊證號：國食藥監械(準)字2013第3401270號）基因芯片方法對患者血樣進行分析。其中載脂蛋白基因分型包括基因的提取 （使用廣州美基生物科技有限公司生產的血液基因組DNA提取試劑盒，備案號：粵穗械備20150062），基因組DNA進行PCR擴增（ABI 2720），使用基因芯片閱讀儀進行產物分析。

1.4 檢測方法 所有研究對象抽取靜脈血1~2ml送檢，載脂蛋白基因分型檢測包括如下步驟：⑴基因的提取；⑵基因組DNA的PCR擴增；⑶使用基因芯片閱讀儀進行產物分析。基因芯片試劑盒所采用的PCR體系是經一系列的優化處理后建立的直用型PCR體系,可以實現對ApoE基因特異性目的片段的有效擴增。進行檢測時,先把待測樣本用樣本處理試劑盒處理后提取DNA,先通過PCR擴增并變性后得到標記的目的寡核苷酸鏈,在特定條件下與含有捕獲探針的功能化基因芯片進行雜交。當反應體系中含有ApoE基因目的核酸時，捕獲探針就會通過互補序列與目的核酸結合，隨后HRP-TMB擴增顯色系統就會啟動,此時生物傳感器功能化涂層就會產生信號放大，呈現藍色，即陽性結果，從而實現結果判讀。

1.5 統計學處理分析 單核苷酸多態性 （SNP）位點的基因型頻率和等位基因頻率通過頻率計算法計算。采用 χ2檢驗分析各 SNP位點是否符合Hardy-Weinberg遺傳平衡,采用統計軟件 SPSS 21.0進行統計分析，計數資料以率表示，組間比較采用χ2檢驗,以 P<0.05為結果差異有統計學意義。

2 結果

2.1 載脂蛋白E基因人群總體分型結果 通過對東莞康華醫院3249例整體人群的脂載蛋白E基因多態性分析，其中ε3等位基因2374例占73.06%（ε3/ε3 型占比 71.68%，ε2/ε4 型為 1.38%）；ε2等位基因 456例占 14.04%（ε2/ε2型為 0.65%，ε2/ε3型占比 13.39%）；而 ε4等位基因 419例占比12.90% （ 其 中 ε4/ε4 型 占 比 0.83% ，ε3/ε4 型 為12.07%）。

圖1 載脂蛋白E在人群中的總體分布

2.2 載脂蛋白E基因等位基因人群總體頻率分布3249例就診者中，ApoE基因的388T>C（rs429358）位點共檢出野生型2758例,雜合突變型437例，純合突變型27例,等位基因突變發生率7.56%。ApoE基因526C>T（rs7412）位點共檢出野生型2748例，雜合突變型480例，純合突變型21例,等位基因突變發生率9.43%。經χ2檢驗分析,上述多態性位點突變頻率觀察值符合Hardy-Weinberg遺傳平衡定律(P>0.5)，具有群體代表性。見表1。

2.3 各組別ApoE基因型和等位基因頻率分布情況及分布差異 冠心病組ε2等位基因占比（10.94%）低于正常對照組 ε2等位基因占比（15.91%），差異具有統計學意義（P<0.01）；且冠心病組ε2等位基因占比低于高血壓組（14.15%），差異具有統計學意義（P<0.01）；與冠心病合并高血壓組比較，差異無統計學意義（P>0.05）。冠心病合并高血壓組ε4等位占比（20.16%）高于正常對照組ε4等位占比（13.98%），差異具有統計學意義（P<0.05），見圖 2 。

表1 ApoE基因多態性頻率分布

圖2 不同人群ApoE基因多態性分布

正常對照組和高血壓組、冠心病組及高血壓合并冠心病組脂載蛋白E基因型和等位基因頻率分布情況比較，見表2。

3 討論

3.1 ApoE基因多態性的分布 對以往國內外文獻的統計結果表明，等位基因中ε3等位基因頻率最高，是任一群體中最常見的等位基因，而ε2和ε4則相對較少，所以ε3被認為是“野生型”。研究對于載脂蛋白E基因型型別的分布，本文所選的樣本人群達到3249例。反應東莞地區脂蛋白E基因多態性的分布其載脂蛋白E的基因型分布與相關文獻一致[8-11]。

3.2 ApoE基因多態性與冠心病的關系 不同載脂蛋白E基因型決定不同的載脂蛋白E配體。在冠心病中不同載脂配體運輸不同的血脂蛋白,特別是在動脈粥樣硬化的脂蛋白[12]。不同的載脂蛋白E基因型別的基因型人群在冠心病中差異明顯。本次統計中冠心病組人群中ε2等位基因比正常對照組人群高；說明ε2等位基因扮演著一個保護基因的角色。這一結論與張漢文等[13]通過對歷年文獻進行的大數據分析中對冠心病與ε4等位基因的關系的結論一致；與其對ε2等位基因的分析結論不一致；這一不一致是由于地域差異引起，還是由于統計偏頗引起尚需進一步研究。

此外，根據最新研究成果，對ε4等位基因攜帶者，棕櫚酸食用量的增加與冠心病風險增加有關[14]，這表明ε4等位基因攜帶者可以通過合理飲食降低相應的冠心病的風險。

3.3 ApoE基因多態性與冠心病合并高血壓的關系冠心病合并高血壓人群中ε4等位基因顯著高于非高血壓非冠心病人群；表明對東莞地區人群，ε4等位基因在高血壓合并冠心病人群中具有較高比例；說明在樣本量足夠的情況下，同一地區（生活習慣相似）的人群中ε4等位基因與罹患冠心病和高血壓的幾率相關。此外，本研究中表明的冠心病合并高血壓人群ε3/3比率低于單純高血壓與單純冠心病；與較早的文獻中,高血壓合并冠心病者ε3/3頻率比僅高血壓有下降的趨勢相一致[14]；可能揭示ε3/3等位基因對高血壓合并冠心病有保護作用。

隨著對載脂蛋白E檢測方法的多樣性，載脂蛋白E基因檢測將會變成快速準確的檢測項目。載脂蛋白E將會積累大量的數據，這將有利于相關脂質代謝類的相關疾病的相關性分析。更多人群數據的積累有助于對慢性非感染性疾病發病機理和作用機制的研究。

同時,大數據分析也使我們發現相關的疾病的基因并不是某一個基因的決定的,而是由多個基因共同決定,也說明一些疾病可能屬于數量性狀遺傳。更多的數據的積累將會使疾病與基因型之間的關系更加清晰,將會為臨床的診斷提供更多的數據支撐。

表2 不同人群載脂蛋白E基因型別分布情況

綜上所述,東莞地區3249例患者ApoE基因多態性分布符合Hardy-Weinberg遺傳平衡定律，具有群體代表性。冠心病合并高血壓組與ε4等位基因呈正相關，冠心病組與ε2等位基因則呈負相關。