EV71對(duì)HFMD 患兒樹突狀細(xì)胞、MAPK 信號(hào)通路及炎性細(xì)胞因子的影響

宋麗，楊金玲

(1.鄭州大學(xué)第三附屬醫(yī)院兒內(nèi)科，河南 鄭州 450052；2.濟(jì)源市婦幼保健院兒科，河南 濟(jì)源 454650)

手足口病 （hand foot mouth disease，HFMD）是臨床上較為常見的兒童流行疾病,相關(guān)臨床隨訪研究顯示,臨床上HFMD的發(fā)病率可達(dá)234~56 6/1萬人左右,在部分大流行或者爆發(fā)的地區(qū),HFM D的發(fā)病率更高[1,2]。

腸道病毒EV71型是導(dǎo)致HFMD感染的重要病原體，對(duì)于腸道病毒EV71型引起的相關(guān)HFMD患兒致病機(jī)制的研究,能夠?yàn)榕R床上HFMD的生物學(xué)治療提供理論基礎(chǔ)。腸道病毒EV71型能夠通過對(duì)樹突狀細(xì)胞（DCS）的激活,誘導(dǎo)體內(nèi)T淋巴細(xì)胞或者體液免疫功能的恢復(fù),并通過激活p-p38 MAP K、p-JNK和p-ERK1/2相關(guān)信號(hào)通路蛋白的上升，促進(jìn)MAPK下游相關(guān)因子的激活,加劇不同的炎癥細(xì)胞對(duì)于皮膚黏膜的損害[3-5]。已有的相關(guān)研究揭示了腸道病毒EV71型的感染與HFMD患兒不良臨床結(jié)局的關(guān)系，但缺乏對(duì)于腸道病毒EV71型在HFMD發(fā)病機(jī)制過程中的相關(guān)生物學(xué)機(jī)制的研究。為了進(jìn)一步揭示腸道病毒EV71型在促進(jìn)HFMD患兒病情進(jìn)展過程中的作用,本次研究選取2016年2月至2017年3月在我院住院治療的HFMD患兒64例，探討了腸道病毒EV71對(duì)DCS細(xì)胞的激活及對(duì)于體內(nèi)細(xì)胞炎癥因子的上調(diào)作用,報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2016年2月至2017年3月在我院住院治療的HFMD患兒64例，其中男35例，女29例；年齡8個(gè)月～5歲，平均年齡（2.01±0.97）歲；輕癥 38例（輕癥組），重癥 26例（重癥組）；納入標(biāo)準(zhǔn)：⑴診斷符合衛(wèi)生部《手足口病診療指南（2010 年版）》和《腸道病毒 71 型（EV71）感染重癥病例臨床救治專家共識(shí)（2011年版）》中標(biāo)準(zhǔn)；⑵實(shí)驗(yàn)室明確為腸道病毒EV71型感染；⑶年齡≤5歲；⑷患兒監(jiān)護(hù)人知情同意。排除標(biāo)準(zhǔn)：⑴有腎病綜合征、免疫系統(tǒng)性疾病等慢性基礎(chǔ)性疾病；⑵先天性心臟病或肺發(fā)育不良者；⑶長(zhǎng)期服用糖皮質(zhì)激素者。同時(shí)選取健康兒童60例作為對(duì)照組，各組受試者性別、年齡比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P＜0.05），見表 1。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

表1 各組一般資料比較

1.2.1 DCs分離、培養(yǎng) 收集30ml外周血，裂解外周血血漿中紅細(xì)胞，離心獲得單個(gè)核細(xì)胞，于青霉素、37℃、5%二氧化碳條件下培養(yǎng),加入100mg/dl的集落刺激因子，50mg/dl的IL-4促進(jìn)DCs的分化。培養(yǎng)第6d后，收集細(xì)胞，調(diào)整濃度為1×109cells/L。

1.2.2 表面標(biāo)志物細(xì)胞數(shù)檢測(cè) 采用流式細(xì)胞儀雙標(biāo)法分別對(duì)CD80和CD83以及CD86和CD11c進(jìn)行檢測(cè)，熒光標(biāo)記分別為CD80-PE/CD83-FITC，CD86-PE/CD11c-FITC,操作于5ml試管中進(jìn)行,100μl DCs細(xì)胞與 CD80和 CD83(CD86和 CD11c)熒光標(biāo)記抗體室溫反應(yīng)25min,采用紅細(xì)胞裂解液optiLYse C溶血素溶解紅細(xì)胞，PBS液體洗滌三遍,每次5min,生理鹽水重新懸浮細(xì)胞,上機(jī)檢測(cè)。(FACS calibur流式細(xì)胞儀購(gòu)自美國(guó)BD公司）。

1.2.3 MAPK信號(hào)通路蛋白檢測(cè) 冰上分離細(xì)胞蛋白,冰上靜置60min,室溫下20000r/min離心60 min，取出下層沉淀。按總蛋白80斗g計(jì)算上樣容積,按照比例為3：1或者4：1的比例上TBS緩沖液，加入20μl緩沖液后于45 V電壓下進(jìn)行電泳操作,脫脂蛋白封閉2h，加入p-p38 MAPK、p-JNK和p-ERK1/2抗體（鼠來源抗體，購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)有限公司）各10μl后室溫下孵育2h，2h后加入二抗，室溫孵育1h（兔來源抗體，購(gòu)自南京凱基生物科技有限公司）。采用日本panasoic公司的HSO-900系統(tǒng)影像分析儀器進(jìn)行圖像分析。

1.2.4 炎性細(xì)胞因子檢測(cè) 收集DCs細(xì)胞上清液，1000r/min離心5min，采用生物酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)相關(guān)指標(biāo)，IL-6和TNF-a、IL-12檢測(cè)試劑盒購(gòu)自羅氏生物檢測(cè)應(yīng)用公司,配套試劑及儀器購(gòu)自南京伯斯金生物科技有限公司。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 統(tǒng)計(jì)分析采用SPSS19.0軟件，計(jì)量資料采用（)表示，多組間比較使用方差分析，兩兩比較采用LSD檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組DCs表面標(biāo)志物檢測(cè)結(jié)果比較 重癥組CD80和 CD83明顯高于輕癥組和對(duì)照組 （P＜0.05）；輕癥組CD80和CD83明顯高于對(duì)照組（P＜0.05）；三組CD86和CD11c比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。說明EV71感染可誘導(dǎo)DC趨向成熟。見表2、表3和圖1。重癥組中死亡和非死亡患兒CD80、CD83、CD86和CD11c比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見表 4。

表2 各組DCs表面標(biāo)志物檢測(cè)結(jié)果比較

表3 各組DCs表面標(biāo)志物檢測(cè)結(jié)果比較(平均熒光強(qiáng)度)

表4 重癥死亡和非死亡患兒DCs表面標(biāo)志物檢測(cè)結(jié)果比較

表5 重癥死亡和非死亡患兒DCs表面標(biāo)志物檢測(cè)結(jié)果比較(平均熒光強(qiáng)度)

2.2 各組MAPK信號(hào)通路相關(guān)蛋白比較 重癥組p-p38 MAPK、p-JNK和p-ERK1/2表達(dá)顯著高于輕癥組和對(duì)照組（P＜0.05）；輕癥組 p-p38 MAPK、p-JNK和p-ERK1/2表達(dá)顯著高于對(duì)照組 （P＜0.05）；說明EV71感染可激活MAPK信號(hào)通路。見表6和圖2。重癥組中死亡和非死亡患兒p-p38 MAPK、p-JNK和p-ERK1/2表達(dá)比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見表 7。

圖1 各組DCs表面標(biāo)志物檢測(cè)結(jié)果圖

表6 各組MAPK信號(hào)通路相關(guān)蛋白比較

表7 重癥死亡和非死亡患兒MAPK信號(hào)通路相關(guān)蛋白比較

圖 2 Western blot法檢測(cè)圖（1：對(duì)照組；2：輕癥組；3：重癥組）

2.3 各組炎性細(xì)胞因子比較 重癥組IL-6顯著高于輕癥組和對(duì)照組（P＜0.05）；重癥組TNF-顯著高于對(duì)照組，但低于輕癥組（P＜0.05）；輕癥組IL-6和TNF-顯著高于對(duì)照組（P＜0.05）；三組 IL-12 比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表8。重癥組中死亡患 IL-6 為（80.42±9.28）pg/ml，明顯高于非死亡患兒（P＜0.05），而 TNF-為（24.02±6.10）pg/ml，明顯低于非死亡患兒（P＜0.05），見表 9。

表8 各組炎性細(xì)胞因子比較

表9 重癥死亡組與非死亡組炎性細(xì)胞因子比較

3 討論

手足口病的病因相對(duì)復(fù)雜,雖然腸道病毒EV 71以及科薩奇病毒科相關(guān)亞組病毒的感染可以導(dǎo)致明顯的腸道局部黏膜腺體以及全身循環(huán)系統(tǒng)表現(xiàn)，特別是明顯的神經(jīng)系統(tǒng)受累表現(xiàn)，但其具體作用機(jī)制無法確定。輕癥手足口病患兒的預(yù)后較好，多數(shù)可在一周內(nèi)自愈，而重癥患兒的發(fā)病較急、化膿性腦膜炎以及腦實(shí)質(zhì)受累的表現(xiàn)可在3~6h內(nèi)引起明顯的腦膜刺激癥狀，進(jìn)而引起呼吸循環(huán)功能衰竭[6,7]。現(xiàn)階段臨床上不同的方式治療HFMD的臨床總體有效率較低，治療后的病情緩解率不足35%[8]，而通過對(duì)于HFMD發(fā)病過程中相關(guān)分子機(jī)制或者生物學(xué)機(jī)制的研究,具有下列幾個(gè)方面的現(xiàn)實(shí)意義：⑴能夠?yàn)榕R床上HFMD患兒的早期疾病診斷或者臨床預(yù)后評(píng)估提供參考；⑵能夠?yàn)榕R床上HFMD患兒的治療提供理論基礎(chǔ),特別是通過對(duì)于信號(hào)通路受體拮抗劑的相關(guān)研究,能夠?yàn)镠FMD的治療提供潛在的參考。

DCS細(xì)胞是體內(nèi)重要的抗原提呈細(xì)胞,其能夠通過促進(jìn)相關(guān)下游CD4T淋巴細(xì)胞或者CD8T淋巴細(xì)胞等的激活，提高患兒局部細(xì)胞免疫功能，改善患者的臨床預(yù)后[9,10]。DCS的表達(dá)或者細(xì)胞濃度的維持，能夠?yàn)楦腥拘约膊〉拿庖咂琳系木S持、提高病原體的吞噬效果等提供幫助[11,12]。MAPK信號(hào)通路不僅能夠在影響到惡性腫瘤的發(fā)生過程中起到一定的作用,同時(shí)還可以在促進(jìn)氧化應(yīng)激反應(yīng)、提高炎癥反應(yīng)的損傷程度,加劇自然殺傷性T淋巴細(xì)胞的自身細(xì)胞毒性作用等,促進(jìn)皮膚黏膜組織或者重要內(nèi)臟器官組織的損傷[13]。

CD80和CD83是評(píng)估DCS細(xì)胞成熟程度的重要細(xì)胞表面抗原,其表達(dá)濃度的上升往往提示DCS細(xì)胞的成熟，T淋巴細(xì)胞免疫活性的提升[14,15]。本次研究中可以發(fā)現(xiàn)的是病例組患者血清中相關(guān)抗原指標(biāo)均明顯高于對(duì)照組,其中重癥組患者的相關(guān)指標(biāo)表達(dá)高于輕癥組,而輕癥組患者高于正常對(duì)照組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,這些均提示了腸道病毒EV71對(duì)于DCS的分化成熟作用,這從機(jī)制上考慮可能與下列幾個(gè)方面的因素有關(guān)：⑴腸道病毒E V71能夠促進(jìn)單核細(xì)胞或者巨噬細(xì)胞表面抗原表位的釋放,通過正反饋機(jī)制促進(jìn)CD80或者CD8 3的表面抗原的濃度的維持。CD86和CD11c等是評(píng)估DCS細(xì)胞另一重要表面抗原,但本次研究中并未發(fā)現(xiàn)相關(guān)指標(biāo)的上升,提示腸道病毒EV71并不能對(duì)于全部的DCS表面抗原均具有一定的協(xié)同刺激作用。馮愛東等[16]在探討了36例樣本量的重癥HFMD患者的血清學(xué)資料后發(fā)現(xiàn),腸道病毒EV71能夠提高25%～65%左右的CD80的表達(dá)陽(yáng)性率，且腸道病毒EV71的感染時(shí)間越長(zhǎng)、病原體擴(kuò)增速度越快，CD80的陽(yáng)性率越高。重癥組p-p38 MAPK、p-JNK和p-ERK1/2相關(guān)蛋白水平的表達(dá)均有所上升,高于輕度組或者對(duì)照組,提示MA PK信號(hào)通路的激活在促進(jìn)HFMD的病情進(jìn)展過程中具有顯著的作用，而腸道病毒EV71可能在影響到MAPK信號(hào)通路的上調(diào)方面發(fā)揮了一定的作用，這主要考慮與腸道病毒EV71對(duì)于MAPK信號(hào)過程中JNK蛋白的轉(zhuǎn)錄或者上游相關(guān)啟動(dòng)子的調(diào)控增強(qiáng)有關(guān)。但是在重癥組中死亡和非死亡患者中，并非發(fā)現(xiàn)MAPK信號(hào)通路蛋白或者CD80等表面抗原的表達(dá)差異,提示相關(guān)分子生物學(xué)因子并不能作為臨床上評(píng)估不同臨床預(yù)后的差異性指標(biāo)。最后,本次研究發(fā)現(xiàn)重癥組IL-6的高表達(dá)及TNF-a的表達(dá)波動(dòng)等，均能夠影響到下游炎癥細(xì)胞的浸潤(rùn)，促進(jìn)皮膚黏膜的損傷，加大病死率的發(fā)生。

綜上所述，EV71可促進(jìn)CDs細(xì)胞成熟,激活MAPK信號(hào)通路,促進(jìn)部分炎性因子釋放；患兒預(yù)后與CDs及MAPK信號(hào)通路未見明顯聯(lián)系。