VEGF 、Ang-2在血管瘤中的表達及臨床意義

薛娟,高磊,王艷秋

（1.河南科技大學臨床醫學院，河南 洛陽 4710002；河南科技大學第一附屬醫院檢驗科，河南 洛陽 471000；3.河南科技大學第一附屬醫院消化內科，河南 洛陽 471000）

血管瘤是由胚胎期間成血管細胞增生而形成的的良性腫瘤,新生兒發病率為1%～2%,女性多見,男女比例約為1：3[1,2]。據統計[3]發生于口腔頜面部的血管瘤占全身的60%，發生于軀干的血管瘤占全身的25%,發生于四肢的血管瘤占全身的15%,其中大多數發生于口腔黏膜、面部皮膚、皮下組織、舌唇等表淺位置，易造成容顏缺損，也有少數發生于頜骨內或深部組織，可影響機體功能甚至危及生命。有文獻報道[4]血管瘤具有血管內皮細胞（VEC）增殖和新生血管生成的特點，而血管生成需血管內皮生長因子（VEGF）和血管生成素(Ang)參與。大量研究證明，VEGF、Ang-2在非小細胞肺癌（NSCLC）[5]、多發性骨髓瘤(MM)[6]、子宮肌瘤[7]等腫瘤組織中異常表達,提示VEGF、Ang-2與腫瘤發生發展相關。但目前國內關于VEGF、Ang-2在血管瘤中表達的研究較少。因此，本研究通過免疫組織化學染色法及RT-PCR檢測VEGF、Ang-2在毛細血管型血管瘤標本、毛細血管畸形標本及正常皮膚組織標本中的表達情況，旨在探討VEGF、Ang-2應用于血管瘤診療的意義，現報告如下。

1 材料與方法

1.1 標本采集 收集2017年1月-2017年9月我院病理科存檔的毛細血管型血管瘤組織標本83例為毛細血管型血管瘤組，請其中男39例,女44例；年齡 1個月~11歲,平均年齡（5.49±1.23）歲。 同期毛細血管畸形組織標本56例為毛細血管畸形組，其中男26例，女30例；年齡1個月~12歲,平均年齡（5.96±1.06）歲。另取同期含有正常血管的皮膚組織標本56例為對照組，其中男27例,女29例；年齡 1個月~13歲,平均年齡（6.11±1.45）歲。 入選標準：⑴行手術切除的皮膚毛細血管型血管瘤患者均經病理檢查證實，且無其他腫瘤病史；⑵毛細血管型血管瘤部位為頜面部、四肢、軀干；⑶毛細血管型血管瘤處于增殖期；⑷入組者資料完整；⑸本研究經本院倫理委員會批準，患者知情同意。排除標準：⑴毛細血管型血管瘤處于退化期；⑵術前口服糖皮質激素；⑶合并內分泌系統疾病。三組標本來源者性別、年齡比較無統計學差異 （P＞0.05）。

1.2 主要試劑 兔抗人VEGF單克隆抗體（Signalway antibody）、山羊血清（Epit Mics）、DAB 顯色試劑盒 （北京中杉金橋生物有限公司）、羊抗鼠IgG（Cell signaling）、兔抗人 Ang-2 單克隆抗體（上海仁捷生物科技有限公司）、PBS磷酸緩沖液（上海恒遠生物科技有限公司）、二甲苯（上海慧穎生物科技有限公司）、蘇木精染色液（上海譜振生物科技有限公司）、梯度酒精（廣州維恩基因科技有限公司）、中性樹脂（梅州市守合科技有限公司）、檸檬酸鈉緩沖液（上海基星生物科技有限公司）、VEGF引物 （上海玉博生物科技有限公司）、Ang-2引物（德國Qiagen）、異丙醇（深圳聚正科技有限公司）、總RNA提取試劑盒（北京博凌科為生物科技有限公司）、1.5%瓊脂糖 （美國AMRESCO公司）、RTPCR擴增試劑盒（北京厚生博泰科技有限公司）。

1.3 RT-PCR 取各組標本按總RNA提取試劑盒操作步驟提取總RNA,檢測RNA濃度及純度,取5μg RNA逆轉錄為 cDNA后行 RT-PCR反應，PCR 反應條件：94℃預變性 4min，94℃變性 60S，58℃退火 60s，72℃延伸 60 S，32 次循環。 將 PCR產物經1.5%瓊脂糖凝膠電泳60min，凝膠成像系統掃描分析，以目的基因與GAPDH吸光度比值計算相對表達量。VEGF、Ang-2mRNA相對表達量計算方法：基因相對表達量=2-△△Ct。

1.4 免疫組織化學SP染色法 將各組標本用組織切片機切成4μm連續切片，脫蠟，高壓抗原修復，PBS漂洗，內源性過氧化物酶滅活，加山羊血清封閉，滴加兔抗人VEGF單克隆抗體（濃度1：200）和兔抗人 Ang-2單克隆抗體 （濃度1：200），4℃孵育過夜，PBS漂洗，滴加生物素標記的羊抗鼠IgG（濃度 1：100），37℃孵育 60 min，PBS 漂洗，DAB 顯色5min，PBS終止反應，蘇木素復染，梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封固，顯微鏡下觀察VEGF、Ang-2蛋白表達。判定標準：由兩位經驗豐富具有獨立執業資格的病理科醫生對染色結果進行評定和復核。每張切片隨機選取5個視野，每個視野計數100個細胞，計算陽性細胞的百分比，按著色細胞百分率記分：陽性細胞率＜5%記作0分，陽性細胞率5%～25%記作1分，陽性細胞率26%～50%記作2分，陽性細胞率＞50%記作3分。按著色強度記分：0分為不著色，淺黃色記作1分，棕黃色記作2分，棕褐色記作3分。著色細胞百分率記分與著色強度記分相乘為最終得分：乘積＜4分為陰性表達，乘積≥4為陽性表達。

1.5 統計學方法 采用spss22.0軟件進行統計分析。計量資料比較采用Kruskal-Wallis H秩和檢驗或單因素方差分析，計數資料比較采用卡方檢驗。P＜0.05表示差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 各組VEGF mRNA表達水平 VEGF mRNA在毛細血管型血管瘤組、毛細血管畸形組中表達量顯著高于對照組,有統計學差異 （P＜0.05）；VEGF mRNA在毛細血管型血管瘤組中表達量顯著高于毛細血管畸形組,有統計學差異（P＜0.05）,見表 1、圖1。

表1 各組VEGF mRNA表達水平(）

表1 各組VEGF mRNA表達水平(）

注：與對照組比較，*P＜0.05；與毛細血管畸形組比較，#P＜0.05

組別 n毛細血管型血管瘤組毛細血管畸形組對照組83 56 56 FP/ /VEGF mRNA 1.28±0.09*#1.23±0.07*1.00±0.06 235.746＜0.001

圖1 各組VEGF mRNA表達水平比較

2.2 各組VEGF蛋白表達水平 VEGF蛋白定位于血管內皮細胞的細胞膜或細胞質中，呈棕黃色或棕褐色顆粒。VEGF蛋白在毛細血管型血管瘤組、毛細血管畸形組中陽性表達率顯著高于對照組，有統計學差異（P＜0.05）；VEGF蛋白在毛細血管型血管瘤組中陽性表達率顯著高于毛細血管畸形組，有統計學差異（P＜0.05），見表 2、圖 2。

2.3 各組Ang-2 mRNA表達水平 Ang-2 mRNA在毛細血管型血管瘤組、毛細血管畸形組中表達量顯著高于對照組，有統計學差異（P＜0.05）；Ang-2 mRNA在毛細血管型血管瘤組中表達量顯著高于毛細血管畸形組，有統計學差異（P＜0.05），見表3、圖 3。

圖2 毛細血管型血管瘤組及毛細血管畸形組VEGF蛋白表達水平（×400）

表2 各組VEGF蛋白表達水平[n(%)]

表3 各組Ang-2 mRNA表達水平(）

表3 各組Ang-2 mRNA表達水平(）

與對照組比較，*P<0.05；與毛細血管畸形組比較，#P<0.05

組別 n毛細血管型血管瘤組毛細血管畸形組對照組83 56 56 HP/ /Ang-2 mRNA 0.56±0.13 0.34±0.08 0.11±0.05 26.438<0.001

圖3 各組Ang-2 mRNA表達水平比較

2.4 各組Ang-2蛋白表達水平 Ang-2蛋白定位于血管內皮細胞的細胞質中,呈棕黃色或棕褐色顆粒。Ang-2蛋白在毛細血管型血管瘤組、毛細血管畸形組中陽性表達率顯著高于對照組，有統計學差異（P<0.05）；Ang-2蛋白在毛細血管型血管瘤組中陽性表達率顯著高于毛細血管畸形組，有統計學差異（P<0.05），見表 4、圖 4。

圖4 毛細血管型血管瘤組及毛細血管畸形組Ang-2蛋白表達水平（×200）

表4 各組Ang-2蛋白表達水平[n(%)]

2.5 VEGF、Ang-2在毛細血管型血管瘤中表達的相關性 VEGF、Ang-2在毛細血管型血管瘤中表達呈正相關（P<0.05），見表 5。

表5 VEGF、Ang-2在毛細血管型血管瘤中表達的相關性

3 討論

血管瘤是嬰幼兒常見的良性腫瘤之一，其生長迅速時易破壞周圍組織，引發潰瘍、感染、出血等并發癥[8]。臨床上治療血管瘤方法很多，手術切除、放射療法、局部封閉療法、冷凍療法等均有一定療效，但由于血管瘤多發生于指趾、眼瞼、舌頭、口唇、鼻尖等特殊部位，如進行手術切除、冷凍療法會導致組織缺損、皮膚萎縮、瘢痕形成，從而影響容貌或機體功能[9]。因此，從分子標志物角度研究血管瘤發病機制可為臨床辨別血管瘤、指導血管瘤治療尋找有效幫助。

目前，對于血管瘤的發病機制尚不清楚，有研究認為[10]其發生與轉化生長因子β(TGF-β)、基質金屬蛋白酶（MMP）等血管生成因子及血管抑制因子 (AIF)、細胞外基質(ECM)有關。有文獻提到[11]血管瘤是由殘余的胚胎成血管細胞向鄰近組織侵入,形成內皮樣條索，經管化后與遺留下的血管相連而形成,血管內皮細胞增殖及血管生成在其病理演變過程中扮演著重要角色。而Taktak-Benamar A等[12]發現VEC增殖可由VEGF或Ang水平異常引起。VEGF是一種由兩條相同肽鏈通過二硫鍵構成的外分泌二聚體糖蛋白,也是一種可擴散的內皮細胞特異性有絲分裂原，能提高血管內皮滲透性，引起血漿蛋白外滲。李莉等[13]研究中提到VEGF為目前已知最強的可直接促進血管生成的血管生成因子（AF），其在多發性骨髓瘤、子宮肌瘤等腫瘤患者血液或癌組織中能夠檢測到，且與患者臨床病理分期密切相關。相關研究顯示[14]VEGF在血管生成、維持血管內皮功能方面可發揮重要作用，其與VEC上的血管內皮生長因子受體1(Flt-1)、血管內皮生長因子受體2（Flk-1）高親和力結合后，可形成受體二聚體，發生自體酪氨酸磷酸化，誘導VEC增殖、移行和分化形成管腔樣結構。Fagiani E等[15]采用免疫組化法檢測VEGF蛋白在增生期、消退期血管瘤中表達情況，發現消退期血管瘤VEGF蛋白表達明顯低于增生期血管瘤,提示VEGF與血管瘤的血管增生有密切關系,這在本研究中也得到了證實。本研究結果顯示，VEGF在毛細血管型血管瘤中呈陽性表達，著色較強，且其表達水平明顯高于毛細血管畸形組及對照組。分析其原因可能是因為,在VEGF刺激下血管內皮生長因子受體Flk-1迅速磷酸化，從而激活絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)通路，加速VEC有絲分裂，造成VEC大量增殖，導致腫瘤形成[16]。

Ang是一族分泌型的生長因子，包括 Ang-1、Ang-2、Ang-3、Ang-4四種分子，其可維持血管完整性，能刺激血管生長。Ang-2為Ang家族中的一種，主要分布于卵巢、子宮、胎盤等與血管重建有關的部位，有研究顯示[17]Ang-2是腫瘤血管新生起始及加強的重要因素，與腫瘤血管形成數目、臨床分期關系密切。結合相關資料[18]我們分析Ang-2對腫瘤血管生成的影響可能與局部微環境有關，當VEGF存在時，Ang-1的天然拮抗劑Ang-2可拮抗Ang-1，破壞血管的穩定性，促進新生血管形成；當VEGF缺乏時，Ang-2可抑制Ang-1，導致血管斷裂，促使血管消退。Solecki G等[19]研究中提到，過度表達Ang-2，鼠血管結構發生改變，由正常樹狀變為蟲蛀狀，VEC從血管表面分離堆積到一起，提示Ang-2與血管變化密切相關。本研究中，Ang-2蛋白定位于血管內皮細胞的細胞質中，呈棕黃色或棕褐色顆粒，且Ang-2蛋白及mRNA毛細血管型血管瘤組中表達水平均顯著高于毛細血管畸形組、對照組，提示Ang-2對病變血管的形成可能具有促進作用。

綜上，VEGF、Ang-2在血管瘤中均呈高表達，二者相互作用可促進血管瘤增殖，其表達情況為臨床診療血管瘤提供了新的方向。