強心合劑對糖尿病心肌病大鼠心肌結構及膠原蛋白表達的影響

宋春暉　龔志剛　李林　付建平　唐娜娜　 劉中勇

[摘要]目的 構建糖尿病心肌病（DCM）大鼠模型，探討強心合劑對DCM大鼠心肌組織膠原蛋白表達的影響。方法 以高糖高脂飼料對大鼠進行喂養，輔助注射鏈脲佐菌素（STZ）予以造模，隨機將SD大鼠劃分成6個組：空白組、強心合劑高、中、低劑量組、DCM模型組以及卡托普利組，每組各30只。通過葡萄糖氧化酶法對空腹血糖進行測定;以放免法來檢測胰島素;HE染色測定大鼠心肌病變情況;運用免疫組化法對大鼠體內的心肌組織基質金屬蛋白酶-9（MMP-9）、Ⅲ型膠原蛋白（Collagen Ⅲ）以及Ⅰ型膠原蛋白（Collagen Ⅰ）的表達進行測定。結果 強心合劑高、中、低劑量組、卡托普利組的空腹血糖水平均低于DCM模型組，胰島素水平均高于DCM模型組，差異有統計學意義（P<0.05）;強心合劑高、中、低劑量組、卡托普利組大鼠的MMP-9、Collagen Ⅲ、Collagen Ⅰ IOD值均低于DCM模型組，差異有統計學意義（P<0.05）;強心合劑中、低劑量組和卡托普利組大鼠的MMP-9、Collagen Ⅲ、Collagen Ⅰ IOD值均高于強心合劑高劑量組，差異有統計學意義（P<0.05）。結論 強心合劑有助于緩解大鼠心肌損傷、降低血糖、升高胰島素，下調大鼠心肌組織MMP-9、Collagen Ⅲ以及Collagen Ⅰ膠原蛋白的表達，為DCM大鼠心肌提供保護，且高劑量的作用更加明顯。

[關鍵詞]糖尿病心肌病;強心合劑;膠原蛋白;基質金屬蛋白酶

[中圖分類號] R541.61? ? ? ? ? [文獻標識碼] A? ? ? ? ? [文章編號] 1674-4721（2019）10（a）-0007-05

[Abstract] Objective To establish the rat model of diabetic cardiomyopathy and explore the effect of Qiangxin Mixture? on collagen expression in myocardial tissue in diabetic cardiomyopathy rats. Methods The rats were fed with high-fat and high-sugar diet and induced by Streptozotocin （STZ） for modeling. The SD rats were randomly divided into blank group， DCM model group， Qiangxin Mixture high， Qiangxin Mixture medium and Qiangxin Mixture low dose group， and Captopril group， with 30 rats in each group. The fasting blood glucose was determine with glucose oxidase method， the insulin was measure by radio-immuno-assay. The histopathological changes of rat myocardium were detected by HE staining， and the myocardial tissue in rats of matrix metalloproteinase-9 （MMP-9）， Collagen Ⅲ， Collagen Ⅰ expression were detected with immunohistochemical detection. Results The fasting blood glucose level of Qiangxin Mixture in the high， medium， low dose groups and Captopril group were lower than those of the DCM model group， and the insulin level were higher than those of the DCM model group， the differences were statistically significant （P<0.05）. The MMP-9， Collagen Ⅲ， Collagen Ⅰ IOD values of Qiangxin Mixture high， medium， low dose group and Captopril group were lower than those of DCM model group， the differences were statistically significant （P<0.05）. The MMP-9， Collagen Ⅲ， Collagen Ⅰ IOD values of Qiangxin Mixture medium， low dose groups and Captopril group were higher than those of Qiangxin Mixture high dose group， the differences were statistically significant （P<0.05）. Conclusion Qiangxin Mixture can alleviate rat myocardial damage， reduce blood sugar and increase insulin in rats and inhibit MMP-9， Collagen Ⅰ， Collagen Ⅲ protein expression in rats myocardial tissue. Qiangxin Mixture has protective effect on myocardium of DCM rats， and the effect of high dose is more obvious.

[Key words] Diabetic cardiomyopathy; Qiangxin mixture; Collagen; Matrix metalloproteinase

社會在穩步發展，居民的生活水平有了顯著提升，糖尿病的患病率也隨之快速增長。截至2045年，世界糖尿病人口數量將達到6.93億[1]，糖尿病將成為對人類健康有極大威脅的流行性疾病[2]。糖尿病心肌病（diabetic cardiomyopathy，DCM）是典型的特異性心肌病，是由糖尿病引起而不伴有其他基礎冠心病、高血壓等心臟疾病[3]。病理變化為心肌細胞肥大、細胞外基質大量沉積或是間質纖維化[4]。如今，DCM的發病機理尚未明確。本研究擬用溫陽活血利水法組方之強心合劑干預DCM大鼠，觀察膠原蛋白在大鼠心肌組織中的表達情況，旨在探討強心合劑對DCM大鼠心肌組織的保護作用，為深入闡明DCM的形成機制和對DCM的防治提供新思路。

1材料與方法

1.1實驗動物

健康SPF級SD大鼠，數量180只，源自湖南斯萊克景達實驗公司（動物許可證號：SCXK湘2016-002），體重（160±20）g，雌雄各半。適應性飼養7 d后進行分組：空白組30只，給予標準大鼠飼料喂養;其余150只給予高脂高糖高熱量飼料（其飼料營養配備比例為豬油10%，蔗糖20%，膽固醇2.5%，膽酸鹽1%，常規飼料66.5%）進行喂養。實驗過程中，全部大鼠均可自由飲水、進食。

1.2實驗藥物

強心合劑（組成：制附片、桂枝、紅花、桃紅、澤蘭、五加皮、葶藶子各10 g，炙黃芪、丹參、茯苓、北山楂、白芍各20 g，益母草15 g，生姜3片，大棗6枚），江西省中醫院藥劑室煎制，藥物經水煎、過濾、濃縮至終濃度分別為1.5、3.0、6.0 g/ml的強心合劑低、中、高劑量組各150 ml，裝瓶封蓋、滅菌后放入-4℃冰箱保存備用。卡托普利（華中藥業股份有限公司，批號：20140910，規格：25 mg/片）換算為大鼠等效劑量，用純凈水溶解，現用現溶。

1.3試劑及儀器

兔抗鼠基質金屬蛋白酶-9（MMP-9）、Ⅲ型膠原蛋白（Collagen Ⅲ）以及Ⅰ型膠原蛋白（Collagen Ⅰ）多克隆抗體（一抗，美國Abcam公司，ab38898、ab34710、ab7778）;DAB顯色和HE染色試劑盒（上海博谷生物科技）;病理切片機（德國RM公司，型號：LEICA RM2135）;組織包埋機（SAKURA，型號：5235，日本）;光學顯微鏡（Olympus-BH2日本，購自Olympus公司）。

1.4實驗分組及處理

大鼠高糖高脂飼料喂養8周，禁食12 h，實驗組大鼠經腹腔注射鏈尿佐菌素（Streptozotocin，STZ）35 mg/kg，（STZ融合到滅菌0.1 mmol/L pH 4.2的檸檬酸緩沖液，其濃度為2%）。空白組大鼠注射給予劑量同等的檸檬酸緩沖液。注射STZ 72 h后，測定每只大鼠的血糖濃度。若血糖濃度≥11.1 mmol/L，提示糖尿病大鼠模型復制成功，將DCM模型復制成功的大鼠采用隨機數字表法分為DCM模型組、溫陽活血利水法組方強心合劑高劑量組、強心合劑中劑量組、強心合劑低劑量組及卡托普利組，每組各30只。

空白組、DCM模型組大鼠灌服劑量相同的蒸餾水。強心合劑高、中、低劑量組灌服劑量分別為3、2、1 g/（kg·d）。卡托普利組大鼠給予卡托普利片，4 mg/（kg·d）。連續灌服12周。

實驗過程中，空白組、DCM模型組、強心合劑高、中、低劑量組以及卡托普利組大鼠死亡的數量分別為0、6、4、5、5、5只。

1.5觀察指標及檢測方法

1.5.1血糖及胰島素的測定? 實驗結束，大鼠禁食12 h，眼眶取血，EDTA抗凝，分離血清，通過葡萄糖氧化酶法來對空腹血糖進行測定，運用放免法檢測血清胰島素水平。

1.5.2 HE染色光鏡檢測心肌組織的結構變化? 收集各組大鼠的左心室心肌組織，將其置入10%中性甲醛液中進行浸泡固定、脫水，然后用石蠟進行包埋，切成4 μm切片，行HE染色，顯微鏡下觀察大鼠心肌組織的結構改變。

1.5.3心肌組織MMP-9、Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ型膠原蛋白表達水平的檢測? 將心肌組織4 μm石蠟切片脫蠟至水，蒸餾水沖洗并進行抗原修復，PBS洗滌后加入山羊血清封閉，MMP-9、Collagen Ⅰ和Collagen Ⅲ型膠原蛋白的表達均選擇免疫組織化學染色法進行測定。高倍鏡下觀察并計算其平均IOD值。

1.6統計學方法

采用SPSS 16.0統計學軟件對數據進行分析，計量資料以均數±標準差（x±s）表示，采用t檢驗，計數資料以率（%）表示，采用χ2檢驗，以P<0.05為差異有統計學意義。

2結果

2.1強心合劑干預后各組大鼠空腹血糖、血清胰島素的變化

強心合劑干預后，實驗組各組大鼠的空腹血糖水平均高于空白組，胰島素水平均低于空白組，差異有統計學意義（P<0.01）;強心合劑高、中、低劑量組、卡托普利組大鼠的空腹血糖水平均低于DCM模型組，胰島素水平均高于DCM模型組，差異有統計學意義（P<0.05）;強心合劑中、低劑量組和卡托普利組大鼠的空腹血糖均高于強心合劑高劑量組，胰島素水平低于強心合劑高劑量組，差異有統計學意義（P<0.05）;強心合劑中、低劑量組和卡托普利組的空腹血糖、胰島素水平比較，差異無統計學意義（P>0.05）（表1）。

2.2強心合劑干預后各組大鼠心肌細胞形態學的變化

HE染色結果顯示：空白組大鼠體內的心肌結構未見異常，心肌細胞胞漿著色相對均勻，其胞核處在細胞中央，形圓或橢圓，大小一致，肌纖維均衡地排列;DCM模型組有少數心肌纖維斷裂，不規則;強心合劑高劑量組、中劑量組大鼠的心肌結構有顯著好轉，肌纖維排列較緊密整齊;卡托普利組與強心合劑低劑量組大鼠心肌纖維排列不規整，部分肌纖維斷裂（圖1）。

2.3各組大鼠心肌組織MMP-9、Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ表達水平的比較

各組大鼠心肌組織MMP-9、Collagen Ⅰ以及Collagen Ⅲ均有不同強度地表達，與空白組比較，各組大鼠MMP-9、Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ的 IOD值均高于空白組，差異有統計學意義（P<0.05）;強心合劑高、中、低劑量組、卡托普利組大鼠MMP-9、Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ 的IOD值均低于DCM模型組，差異有統計學意義（P<0.05）;強心合劑中、低劑量組和卡托普利組大鼠的MMP-9、Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ的 IOD值均高于強心合劑高劑量組，差異有統計學意義（P<0.05）;強心合劑中、低劑量組與卡托普利組大鼠MMP-9、Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ的 IOD值比較，差異無統計學意義（P>0.05）（表2、圖2）。

3討論

中醫古籍上雖無DCM的名稱記載，但可納入“消渴病”并發“心悸”或是“胸痛”等諸病范疇。筆者恩師劉中勇教授認為DCM的病機實質是心痛陽虛水停，陰乘陽位，二者相互搏結，氣血運行不暢，瘀血阻滯而成，治療上，強調溫陽活血利水法，并且以此法立方-強心合劑，在臨床上治療心肌病及心力衰竭患者中取得了滿意的效果[5-6]。全方振陽以附子為主，補氣血以炙黃芪為主，二者聯用視作君藥;桂枝性溫，能夠助陽化氣;桃仁、丹參以及紅花三藥合用，能夠達到活血祛瘀之目的，加速生血;澤蘭和益母草均有活血、利水之雙重功效;茯苓、葶藶子及五加皮能夠達到利水去濕之效;山楂能夠祛瘀消食，調補胃氣;佐以白芍、桂枝及制附子等藥熱毒之效;大棗、生姜能夠對脾胃進行調和。諸藥配伍，內合五苓散、真武湯、葶藶大棗瀉肺湯等方之意，可達到益氣升陽、活血利水之功。

近年來，研究證實，DCM是一種主要表現為心律失常和心功能不全的特異性心臟病[7]。DCM的發病機制復雜，與炎癥、氧化應激、葡萄糖代謝障礙、心肌間質纖維化等因素密切相關[8]。在心臟發育過程中，成纖維細胞通過產生膠原蛋白分布到組織間隙中從而為心肌細胞提供支撐結構和維持心肌正常的收縮和舒張功能[9]。心臟組織內部的外基質成分中，80%以上都是Collagen Ⅰ[10]，表達上升可加大心肌僵硬度，而Collagen Ⅲ的表達則決定心肌的順應性[11]。在病理狀態下，心臟成纖維細胞分泌過多膠原，分布在心肌組織間隙當中，誘發心肌纖維化[12]。本研究構建DCM大鼠動物模型，采用高糖高脂飼料聯合注射鏈脲佐菌素方法[13]，旨在先誘發胰島素抵抗再破壞胰腺β細胞的部分功能，該方法處理的大鼠心肌組織出現了Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ的表達增多，與相關研究一致[14-15]，反應心肌組織間隙大量膠原沉積是引起DCM的重要因素。強心合劑可減少DCM大鼠心肌組織中Collagen Ⅰ和Collagen Ⅲ的蛋白表達，提示強心合劑能夠幫助糖尿病大鼠減輕心肌纖維化。

正常情況下，心肌間質膠原處于持續不斷更新的動態平衡狀態。膠原合成和降解同時進行，使細胞外基質成分保持穩定。在細胞外基質重構參與的DCM發病研究中發現，DCM患者血清中MMP-2與MMP-9蛋白的表達水平明顯升高，而基質金屬蛋白酶抑制因子-1（TIMP-1）和TIMP-2蛋白的表達明顯降低，提示細胞外基質的成功降解與重構均可介入DCM的病發過程[16]。基質金屬蛋白酶（MMPs）的活性變化，在心肌間質纖維化中擔任極其重要的角色[17]。心肌MMPs作為基質降解必備的調節因子，其活性增強見于DCM中[18]。MMP-9是心肌組織Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ膠原完全降解的限速酶[19]，對Collagen Ⅰ及Collagen Ⅲ膠原實際的降解速度起決定性的作用[20-21]。相關報道顯示，DCM大鼠的心肌膠原纖維顯著性增多，MMP-9和TIMP-1的表達上升，兩者組合而來的MMP-9/TIMP-1復合物能夠減少和抑制MMP-9降解膠原[22]。

本研究中，各組實驗大鼠的心肌MMP-9表達情況提示MMP-9參與了DCM的發生發展過程，DCM組大鼠心肌組織中表達增加的MMP-9降低了Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ膠原降解速度，組織間隙中膠原表達增多，加快了心肌纖維化進程。強心合劑能夠明顯下調大鼠心肌組織中Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ膠原和MMP-9的表達，緩解細胞纖維化程度，從而提示強心合劑對DCM大鼠的心肌結構及功能，具有保護作用，且高劑量的作用更加明顯，為中藥溫陽活血利水法防治DCM提供了客觀依據。

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（收稿日期：2019-05-10? 本文編輯：閆? 佩）