微波預(yù)處理法制備茶粕基有機藥肥工藝研究

胡福田　周紅軍　徐華　周新華　戴修純

摘要：以油茶餅粕為原材料，采用微波預(yù)處理法，以水作提取溶劑，通過單因素試驗研究液固比、溫度、時間和pH值對油茶餅粕中茶皂素、蛋白質(zhì)提取率的影響，并采用正交試驗確定最佳提取工藝條件。結(jié)果表明，在液固比為 7 mL ∶1 g，浸提時間為2.5 h、pH值為10、浸提溫度為65 ℃時，茶皂素的提取率可達13.93%，蛋白質(zhì)提取率可達6.92%。

關(guān)鍵詞：油茶餅粕;茶皂素;蛋白質(zhì);微波;浸提工藝

中圖分類號：S141.9 文獻標(biāo)志碼： A

文章編號：1002-1302（2019）19-0295-04

收稿日期：2018-07-03

基金項目：廣東省科技計劃（編號：2014A020208127、2017A04045053）;廣東省農(nóng)業(yè)廳科技計劃（編號：2017LM4177）。

作者簡介：胡福田（1968—），男，博士，副教授，主要從事精細(xì)化工類和農(nóng)副產(chǎn)品綜合利用研究。E-mail：hftian2002@163.com。

為了減輕化學(xué)農(nóng)藥和化肥造成的污染，實現(xiàn)2020年農(nóng)藥化肥零增長的目標(biāo)，植物源有機藥肥的研究與開發(fā)成為當(dāng)前熱點[1-4]。茶粕中含有12%～18%茶皂素、7%～12%蛋白質(zhì)以及氨基酸、多糖等物質(zhì)，是一種非常有市場與應(yīng)用前景的植物源有機藥肥[5-7]。在實際生產(chǎn)中，茶粕基本上是直接被使用，有效成分利用率低，藥效、肥效差。因此，亟需將茶粕有效成分提取出來使用，以提高其利用率，增強其藥效和肥效。但一般用熱水浸提茶粕時，茶皂素浸提率低[8]，且水性茶粕提取液性能不穩(wěn)定，茶粕中的水解酶可導(dǎo)致茶皂素水解沉淀[9]，茶粕中的霉菌易引發(fā)浸提液霉變腐敗變質(zhì)，這是限制其作為藥肥使用的技術(shù)難題。

微波具有熱效應(yīng)和非熱效應(yīng)等多種特性。微波熱效應(yīng)可導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)的極性物質(zhì)尤其是水分子吸收微波能，使胞內(nèi)溫度迅速上升，水汽化后將細(xì)胞膜和細(xì)胞壁沖破，形成微小的孔洞，使表面出現(xiàn)裂紋，此時胞外溶劑容易進入細(xì)胞內(nèi)，溶解并釋放出胞內(nèi)物質(zhì)[10-11];微波非熱效應(yīng)則可殺菌除酶。本研究先用微波預(yù)處理茶粕粉末來破壁殺菌除酶，再通過熱水浸提制備茶粕基植物源有機藥肥，以期為茶粕綜合利用提供新的途徑。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

油茶餅粕由廣東省梅州市梅江區(qū)富強客家特產(chǎn)經(jīng)營部提供，茶皂素標(biāo)準(zhǔn)樣品購于上海博蘊生物科技有限公司。生化試劑牛血清蛋白為標(biāo)準(zhǔn)樣品;酒石酸鉀鈉、五水硫酸銅、碘化鉀、氫氧化鉀、鹽酸、無水乙醇、硫酸、香草醛均為分析純。

所用儀器為PHS-3C型數(shù)顯精密酸度計、RE-85Z型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器、HH-1型電熱恒溫水浴鍋、DGG-9140A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱、DZG-6020型真空干燥箱、VIS-7200型紫外可見分光光度計、G8023CSL-K 3型微波爐（格蘭仕）、HJ-3 型數(shù)碼恒溫磁力攪拌器。

1.2 試驗方法

1.2.1 原料微波預(yù)處理

油茶粕餅干燥后，粉碎，過300目篩，取篩過物進一步干燥至含水量為4%。精確稱量20 g粉末，以800 W功率微波處理150 s。

1.2.2 熱水浸提制藥肥

對微波處理過的粉末按某一液固比、溫度、時間、pH值浸提，浸提后過濾，濾液加鹽酸調(diào)pH值為5.2，在真空（真空度0.09）、溫度為70 ℃條件下濃縮得到提取液，備用。

1.2.3 茶皂素的測定

1.2.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

精確稱取茶皂素標(biāo)準(zhǔn)樣品 0.1 g，用80%乙醇溶液溶解并定容至100.00 mL，搖勻，配制成1.0 mg/mL溶液。分別取標(biāo)準(zhǔn)溶液0.00、0.20、0.40、0.60、0.80、1.00 mL置于10 mL容量瓶中，并加80%乙醇分別將體積補充至1.0 mL，再分別加入8%香草醛乙醇溶液 1.0 mL，將容量瓶移至冰水中，用77%硫酸水溶液定容，搖勻，于60 ℃下加熱30 min，進行顯色反應(yīng);然后置于冰水中冷卻10 min，取出置于室溫下，以第1支容量瓶作空白對照，于550 nm下測吸光度。

1.2.3.2 樣品的測定

將“1.2.2”節(jié)中待測濾液稀釋為含茶皂素量在0.7 mg/mL左右的樣品溶液，精密吸取1.0 mL，置于10 mL具塞磨口試管中，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線的測定方法，測定吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算樣品中茶皂素的含量，進而計算茶皂素提取率，其公式如下：

茶皂素提取率=（浸提液中茶皂素質(zhì)量/原料質(zhì)量）×100%。（1）

1.2.4 蛋白質(zhì)的測定

1.2.4.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

雙縮脲試劑的配制：準(zhǔn)確稱取 4.00 g 五水硫酸銅、2.49 g碘化鉀、28.00 g氫氧化鉀、10.00 g 酒石酸鉀鈉，分別溶解于蒸餾水中，定容到1 000 mL。按照牛血清蛋白試劑標(biāo)簽中給出的蛋白質(zhì)含量，計算稱樣量后，準(zhǔn)確稱取牛血清蛋白，以28 g/L氫氧化鉀水溶液配制成含量約為4 mg/mL的蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液。分別取蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液0.0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mL置于10 mL具塞比色試管中，用蒸餾水補齊至1.0 mL，然后向各比色管中加入 4.0 mL 雙縮脲試劑，混勻，室溫（25 ℃）下反應(yīng)30 min。以第1支試管作空白對照，在540 nm波長測定吸光度。

1.2.4.2 樣品的測定

將“1.2.2”節(jié)中待測濾液稀釋為含蛋白質(zhì)量在1.5 mg/mL左右的樣品溶液，精確吸取1.0 mL，置于10 mL具塞磨口試管中，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線的測定方法，測定吸光度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算樣品中蛋白質(zhì)的含量，進而計算蛋白質(zhì)提取率，其公式如下：

蛋白質(zhì)提取率=（浸提液中蛋白質(zhì)質(zhì)量/原料質(zhì)量）×100%。（2）

2 結(jié)果與討論

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

以茶皂素濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖1），得到的曲線回歸方程為y=0.969 7x+0.005 3，其相關(guān)系數(shù)為r2=0.999 8。以蛋白質(zhì)濃度為橫坐標(biāo)，以吸光度為縱坐標(biāo)作標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖2），得到的曲線回歸方程為y=0.281 1x+0.003 5，其相關(guān)系數(shù)為r2=0.999 9。

2.2 微波預(yù)處理對工藝特性的影響

取“1.2.1”節(jié)微波處理粉末10 g，同時取未處理粉末10 g為空白對照，分別在相同條件下（溫度60 ℃、液固比 7 mL ∶1 g、pH值10、2.5 h）浸提，其浸提液過濾特性、霉變特性、穩(wěn)定性以及茶皂素、蛋白質(zhì)的提取率如表1所示。

由表1可知，微波處理粉末的茶皂素提取率高于未處理粉末，其原因主要是微波熱效應(yīng)導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)的水汽化，將細(xì)胞膜和細(xì)胞壁沖破，形成微小的孔洞，使細(xì)胞表面出現(xiàn)裂紋，浸提時熱水容易進入細(xì)胞內(nèi)溶解胞內(nèi)物質(zhì)。同時，微波熱效應(yīng)和非熱效應(yīng)都有可能使某些蛋白質(zhì)變性，改變蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，使水溶性蛋白質(zhì)減少，蛋白質(zhì)提取率降低;但微波處理避免了水溶性蛋白質(zhì)形成膠體溶液，使浸提后液固分離的處理（過濾）變得簡單。同時微波處理殺死了茶粕中的霉菌，并使茶皂素水解酶失活，達到了較理想的處理效果。

2.3 浸提時間對提取率的影響

在浸提液固比為6 mL? ∶1 g、pH值為10、浸提溫度為 60 ℃ 的條件下，考慮不同浸提時間對茶皂素和蛋白質(zhì)提取率的影響，結(jié)果如圖3所示，在浸提1 h時，提取率較低，隨著時間的增加，提取率首先明顯提升，這是由于浸提時間少時，浸提溶劑與茶粕粉末接觸的時間短，浸提溶劑還沒完全將茶皂素和蛋白質(zhì)充分溶出。浸提在2 h以后，蛋白質(zhì)的提取率基本保持不變，水溶性蛋白質(zhì)接近溶解平衡，茶皂素的提取率還有少量的提升。由于茶粕粉末內(nèi)部溶質(zhì)的溶解及擴散都需要一定的時間，所以延長提取時間有利于茶皂素提取完全，提取率會相應(yīng)有所提高。但是，隨著時間的繼續(xù)增加，液相主體溶質(zhì)的濃度增加，傳質(zhì)推動力減小，提取的速度下降，使得生產(chǎn)能力降低。所以選擇2～3 h作為后續(xù)試驗的提取時間。

2.4 浸提溫度對提取率的影響

在浸提液固比為6 mL? ∶1 g、pH值為10、浸提時間為2 h的條件下，考慮不同浸提溫度對茶皂素和蛋白質(zhì)提取率的影響，結(jié)果如圖4所示，隨著溫度的升高，茶皂素和蛋白質(zhì)的提取率首先有明顯提升。至60 ℃以后，茶皂素提取率稍有降低，由于溫度升高，茶皂素的溶解度增加，浸提液中的茶皂素濃度有所增加，同時溫度的升高會使溶液的黏度下降，擴散系數(shù)增大，這有利于茶皂素的浸出。但是，當(dāng)浸提溫度超過 60 ℃ 時，蛋白質(zhì)的提取率明顯下降，可能是由于蛋白變性析出導(dǎo)致的。所以選擇55～65 ℃作為后續(xù)試驗的溫度范圍。

2.5 浸提液固比對提取率的影響

在浸提時間為2 h、pH值為10、浸提溫度為 60 ℃ 的條件下，考慮不同浸提液固比對茶皂素和蛋白質(zhì)提取率的影響，結(jié)果如圖5所示，在液固比較小的情況下，茶皂素和蛋白質(zhì)的浸取率較低，隨著液固比的增加，提取率逐漸增加，這是因為隨著液固比的增大，浸提溶劑的量增多，達到溶解平衡時會有更多的蛋白質(zhì)和茶皂素被提取出來。在液固比較大的情況下，因為蛋白質(zhì)和茶皂素已基本溶出，且隨著液固比的增加，提取率增長很少，而后續(xù)濃縮的工作量和能耗增加很多。所以選擇（6～8） mL ∶1 g作為液固比參數(shù)范圍。

2.6 浸提液pH值對提取率的影響

在浸提液固比為6 mL? ∶1 g、浸提時間為2 h、浸提溫度為 60 ℃ 的條件下，考慮不同浸提液pH值對茶皂素和蛋白質(zhì)提取率的影響，結(jié)果如圖6所示，茶皂素的提取率首先隨著提取液pH值的逐漸增大而增大，在pH值為10.0時，提取率達到最大，隨后呈下降趨勢。其原因在于茶皂素溶液的pH值為5.5～6.5，偏酸性;當(dāng)提取液偏堿性時，更容易使茶皂素從茶粕粉末中釋放到提取液中，但是當(dāng)pH值過大時，茶皂素在堿性條件下會發(fā)生水解，反而使提取液中茶皂素含量降低。隨著pH值的增大，蛋白質(zhì)的提取率首先增高，當(dāng)pH值大于10.0時，提取率趨于平緩，或有所降低。理論上講，在堿性范圍內(nèi)，pH值越高，蛋白質(zhì)溶出率越高，但是堿性過強會引起蛋白質(zhì)極端變性，團聚沉降，使水溶性蛋白質(zhì)含量降低;同時部分蛋白質(zhì)會發(fā)生水解。因此，選擇pH值為9～11作為后續(xù)試驗的pH范圍。

2.7 正交試驗優(yōu)化結(jié)果與分析

通過對各單因素試驗結(jié)果的分析，得到正交試驗的各因素取值范圍。綜合考慮，選擇浸提時間、液固比、溫度、pH值4個因素進行正交試驗，設(shè)計3個水平，因素水平見表2，正交試驗結(jié)果見表3。

根據(jù)正交試驗結(jié)果可知，影響茶皂素、蛋白質(zhì)提取率因素的主次是不相同的，各因素對茶皂素提取率的影響程度按照R值從大到小依次是pH值>液固比>溫度>時間，各因素對蛋白質(zhì)提取率的影響程度按照r值從大到小依次是pH值>液固比>時間>溫度，其中pH值和液固比對茶皂素、蛋白質(zhì)的提取率影響較大，溫度和時間的影響較小;茶皂素與蛋白質(zhì)提取的最佳組合條件均為A2B2C2D3，即液固比為 7 mL ∶1 g、浸提時間為2.5 h、pH值為10、溫度為65 ℃。對提取率最佳組合進行驗證發(fā)現(xiàn)，茶皂素提取率為13.93%，蛋白質(zhì)提取率為6.92%。

3 結(jié)論

本研究采用微波預(yù)處理法制備茶粕基植物源有機藥肥。通過對比試驗得出，茶粕粉經(jīng)過微波預(yù)處理后，熱水浸提時茶皂素提取率增加，蛋白質(zhì)提取率略微減少，但改善了過濾操作，產(chǎn)品不會霉變、穩(wěn)定性好。通過4個因素的單因素試驗和正交試驗得出，茶皂素與蛋白質(zhì)提取的最佳組合條件均為液固比7 mL ∶1 g、浸提時間2.5 h、pH值10、溫度65 ℃。通過驗證表明，在最佳條件下，茶皂素提取率為13.93%，蛋白質(zhì)提取率為6.92%。該工藝為茶粕綜合利用提供了新的途徑。

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