基于基因多態性研究老年男性骨質疏松癥腎虛證的發生機制*

陳 瑜

浙江省杭州市富陽區第一人民醫院 浙江 杭州 311400

本研究結合老年男性骨質疏松癥腎虛證臨床觀察和研究基礎，以生物信息學、基因多態性檢測等現代技術為手段，探討VDR、AR、CYP19基因單核苷酸多態性（SNPs）的分布差異與骨密度之間的關系。

1 材料與方法

1.1 臨床資料：選擇我院漢族男性就診者和體檢者178例（年齡≤60歲），其中骨質疏松癥腎虛證患者98例，體檢腎虛證者80例。西醫診斷標準參照《中國人骨質疏松癥診斷標準專家共識（第三稿）》。中醫證候診斷參照全國中西醫結合虛證與老年病研究專業委員會1986年制定的標準和《中藥新藥臨床研究指導原則》。排除繼發性骨質疏松、其他嚴重疾病干擾骨代謝者、3月內使用過其他影響骨代謝藥物的患者。

1.2 方法：分述如下。

1.2.1 骨密度測定：采用美國好樂杰QDR-4500雙能X線骨密度儀檢測患者正位腰椎(L2～L4)，左側髖部，包括股骨頸(Neck)、Wards三角、大轉子(Torch)、股骨粗隆(Trock)的骨密度BMD(g/cm2)。

1.2.2 SNPs測定：采集所有受試者靜脈血2.5ml，于EDTA抗凝管儲存。提取外周血白細胞DNA于-20℃儲存。①VDR基因等位基因測定：利用PCR對目的基因進行擴增，選用Fok I上游引物：5'-AGCTATGTAGGGCGAATCATGT-3'，下游引物：5'-TCCAAGAGAGTCAGAGGAACATC-3'。擴增反應體系20μl，包含100ng基因組DNA，dNTP混合液200μmol/L，5×PCR反應緩沖液4μl，Taq聚合酶1U，2μlPCR引物。預變性94℃，5min；變性94℃，20s，退火60℃，30s，延伸72℃，20s，循環35次。循環結束后，72℃延伸7min。對PCR產物進行膠回收保證DNA濃度及純度。PCR產物用FokI限制性核酸內切酶(由NEB提供)酶切后，將樣品置于1%的瓊脂糖凝膠電泳確定基因型。②CYP19基因(TTTA)n多態性測定：利用PCR對目的基因進行擴增，選用CYP19上游引物：5'-CGGTATGCATGAGAAAGGCAT-3'，下游引物：5'-GGTCACTCCTGCCTGGGTG-3'。PCR體系與①中所述相同。PCR產物送樣測序分析。③AR基因(CAG)n多態性測定：利用PCR對目的基因進行擴增，選用AR上游引物：5'-CCAGAATCTGTTCCAGAGCGTGC-3'，下游引物：5'-CCTCATCCAGGACCAGGTAGCCT-3'。PCR反應體系與①中所述相同。PCR產物送樣測序分析。

1.3 統計學處理：采用SPSS 20.0軟件進行統計分析。計量資料以均數±標準差表示，χ2檢驗用于VDR，CYP19，AR基因SNPs基因型以及等位基因頻率是否符合Hardy-Weinberg平衡定律；兩組數據組間基因型和等位基因頻率的比較用χ2檢驗；均數比較采用t檢驗；兩組以上均數比較采用單因素方差分析；檢驗水準為α=0.05，P＜0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 VDR基因等位基因頻率分布：根據VDR基因FokI酶切結果（圖1），我們對骨質疏松腎虛證老年男性患者與體檢腎虛證組老年男性進行基因型及基因頻率分析。如圖1所示，與體檢腎虛證者組相比較，骨質疏松腎虛證老年男性患者基因型分布具有顯著性差異（P＜0.05），骨質疏松腎虛證患者中FF基因型較多，Ff型顯著減少，f等位基因頻率顯著減少（c2=12.731P=0.002），提示著FF基因型可能具有較高的骨質疏松發生率（見表1）。

圖1 部分樣品FokI酶切結果

表1 VDR基因FokI基因型及等位基因頻率

2.2 AR基因（CAG）n基因頻率及與骨密度的關系：AR（CAG）n重復序列測序結果表明，全部樣本AR（CAG）n重復次數介于13～33，平均21。骨質疏松腎虛癥患者人群中 AR（CAG）n重復數最短為 13，最長為 34，平均值為22.67± 3.55，重 復 數 最 多 為 20（10.20%）和 23（26.53%），見表2；體檢腎虛證組人群中AR（CAG）n重復數平均值為21.73±2.96，與骨質疏松腎虛癥患者人群比較差異不顯著（P＞0.05），重復數最多為20（32.50%）和24（10%）。結果表明AR基因（CAG）n各短串聯重復序列多態性與骨密度無相關性。

2.3 CYP19基因(TTTA)n多態性分布：與體檢腎虛證組相比，骨質疏松腎虛證組患者CYP19基因（TTTA）n純合基因型TCT/TCT基因頻率明顯增高，雜合與純合-/-型明顯降低（P＜0.05）；骨質疏松腎虛證組患者的TCT等位基因頻率明顯增高（P＜0.05），見表2。

表2 CYP19基因(TTTA)n多態性分布

2.4 CYP19基因(TTTA)n多態性與骨密度的關系：CYP19基因為TCT/-、-/-型的老年男性，其腰椎L2～L3、股骨頸(Neck)、Wards、股骨粗隆的骨密度要明顯低于TCT/TCT型老年男性（P＜0.05，P＜0.01）。而TCT/-、-/-型的老年男性之間比較，各部位的骨密度無顯著變化（P＞0.05）。多元線性回歸分析發現，CYP19不同基因型的分布與腰椎L2～L3、股骨頸、Wards及股骨粗隆的骨密度存在著顯著相關（P＜0.05），見表3、表4。上述結果說明CYP19基因的TCT/-型、-/-型與低骨密度密切相關。

表3 CYP19基因(TTTA)n多態性與骨密度的關系

表4 CYP19基因(TTTA)n多態性與骨密度的相關性分析

3 討論

中醫學“骨痿”與“骨痹”的闡述，可對應骨質疏松的癥狀。《素問·瘺論》論述，“腎氣熱”是致“骨痿”的主要誘因。腎藏精生髓生骨，“腎實則骨有生氣”，中醫學認為腎臟與骨生理關系密切。特別是老年人腎臟虛虧，腎精不足，精不生髓，髓不足則筋骨枯萎，是為“骨痿”，可見骨質疏松癥與腎虛證具關聯性[1]。維生素D受體的功能及蛋白表達是受VDR基因多態性的調控的，通過VDR的調節維生素D能夠在體內進一步的調節鈣磷代謝平衡，促進成果細胞和破骨細胞的生長發育，并進一步的促進骨形成和骨吸收。VDR基因多態性影響骨代謝及骨質疏松癥，特別是與老年女性骨質疏松癥關系緊密[2]。研究表明腰椎骨、股骨頸和全身的平均骨密度與VDR多態性存在著一定的關聯[3]。本研究中VDR基因多態性影響老年男性骨質疏松癥腎虛證患者骨密度，與其他報道一致。

研究表明TTTA等位基因可能會造成CYP19功能編譯從而影響雌激素合成過程中的芳香族酶活性進而影響了激素調節途徑從而造成骨質疏松發生。文獻報道了CYP19基因3號外顯子的沉默多態性會導致骨質疏松發生，同時CYP19基因（TTTA）n雜合型和純合顯性型會影響絕經后婦女患骨質疏松的發病風險。本研究對雌激素合成調控基因CYP19基因多態性進行分析，發現CYP19基因（TTTA）n串聯重復多態性與骨質疏松存在著顯著相關性。

雖然研究表明AR可以激活破骨細胞分化因子RANKL來間接發揮作用促進骨代謝[4]。但本試驗開展的雄激素受體AR基因多態性研究分析顯示，AR基因（CAG）n短串聯重復序列多態性與骨密度無顯著相關。綜上所述，本研究發現VDR、CYP19基因多態性與老年男性骨質疏松腎虛證存在相關性，這為臨床診治骨質疏松癥腎虛證提供了新的線索。