基于均勻設計和逐步回歸的熱纖梭菌發酵產糖的培養基優化研究

朱新術，趙文慧，張苗，楊學藝，陳曦，胡秀秀

（1.江蘇護理職業學院醫學技術學院，江蘇淮安 223005；2.江蘇護理職業學院醫學基礎部，江蘇淮安 223005）

熱纖梭菌是一類能夠特異降解木質纖維素的高溫厭氧菌[1]，目前大多數學者集中于利用熱纖梭菌產乙醇研究[2]，直接利用該菌發酵濾紙進行產葡萄糖和纖維寡糖的研究并不多見[3]。葡萄糖在發酵工業、畜牧業和食品工業中有重要應用。在動物保健領域，纖維寡糖和益生菌復合制劑，主要用于改善熱應激肉雞腸道功能[4]和氮排放研究[5]，并能改善斷奶仔豬腹瀉情況和提高飼料利用率[6]等。

實驗室前期已用熱纖梭菌常規培養基GS-2 進行了發酵濾紙產葡萄糖和可溶性總糖研究，但糖得率和濾紙轉化率并不高。本文首先分別利用均勻設計，得到GS-2 培養基中對產糖影響較大的7 個因素及其取值范圍，接著通過逐步回歸建立培養基成分和優化目標間的二次多項式回歸模型，并用Matlab 軟件包優化工具箱中的fmincon函數在培養基成分的取值范圍內求取回歸模型的最優解和最優值。最后實驗驗證方程程的有效性，并用HPLC 分析纖維寡糖的成分。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

熱纖梭菌ATCC 35609 野生株，由美國Oklahoma 大學周集中教授饋贈；酵母粉，分析純，英國OXOID 公司；纖維寡糖標準品購自國藥集團化學試劑有限公司；其他試劑均為市售國產分析純級。

0.22μm 濾膜，Millipore；普通紫外可見分光光度計，北京普析通用儀器有限責任公司；SBA-40E 雙通道生物傳感分析儀，山東省科學院生物研究所；高速離心機（Neofuge 23R），上海力申科學儀器有限公司；高效液相色譜儀Waters1525。

1.2 實驗方法

1.2.1 培養基配制

種子培養基為GS-2 培養基（g/L），KH2PO41.5；K2HPO4·3H2O 3.8；尿素2.1；MgCl2·6H2O 1.0；CaCl2·2H2O 0.15；FeSO4·7H2O 0.00125；半胱氨酸鹽酸鹽1.0；纖維二糖5.0；morpholinopropane sulfonic acid(MOPS)10.0；酵母粉6.0；Na3C6HO7·2H2O 3；氧化還原指示劑刃天青0.002；初始pH 7.4。

發酵培養基由濾紙（剪成0.5-4cm）、酵母粉、氯化鎂、半胱氨酸、尿素、硫酸亞鐵、磷酸氫二鉀、磷酸二氫鉀、氯化鈣構成，其中濾紙濃度為20g/L，刃天青0.002g/L 和FeSO4·7H2O 0.00125g/L，其余成分具體配比見表1，初始pH 8.0±0.02。

1.2 培養條件

熱纖梭菌種子60℃培養1d。然后以4%（v/v）接種量接種到發酵培養基中，60℃培養8d。均用100 mL 厭氧瓶，裝液量為40 mL 進行培養。

1.3 測試方法

1.3.1 葡萄糖測定方法

發酵液10,000rpm,4℃離心5min，取上清液，然后用0.22μm 濾膜過濾，濾液稀釋到一定倍數，使葡萄糖濃度在1g/L 以下，并用生物傳感器測定葡萄糖的濃度。

1.3.2 可溶性總糖測定方法

采用蒽酮-硫酸法[7]測定濾液中可溶性總糖的濃度。

1.3.3 纖維寡糖含量測定

用HPLC 法測定濾液中纖維寡糖的濃度[8]。

1.4 試驗設計

本實驗選取發酵培養基中酵母粉、氯化鎂、半胱氨酸鹽酸鹽、K2HPO4、KH2PO4、尿素和氯化鈣進行均勻設計優化試驗，其余成分保持為初始培養基中的濃度狀態。參考《均勻設計與均勻設計表》[9]，選用U10*(108)均勻設計表安排7 因素10 水平的優化實驗（表1），并把初始培養基作為對照，同時進行發酵實驗。

1.6 數據分析

所有配方均進行三組平行實驗，結果以均值±標準誤為準。均勻設計實驗中培養基成分和葡萄糖與可溶性糖之間的二次多項式回歸模型建立通過MATLAB 軟件包(R2018b,Mathworks,USA)逐步回歸函數stepwise 實施；葡萄糖和可溶性總糖的二次多項式回歸模型在自變量的取值范圍內，利用MATLAB 優化工具箱中的fmincon 函數求取培養基最佳組合和相應的優化目標最佳預測值。

表1 均勻設計U10(*108)實驗

2 結果與分析

2.1 均勻設計實驗發酵結果

表2 葡萄糖與可溶性總糖回歸模型效果

利用表2 中的發酵培養基配方進行發酵實驗后，測得每種培養基組合相應的葡萄糖與可溶性總糖的濃度。易知葡萄糖濃度為1 號實驗和9 號實驗獲得，分別為7.75 g/L 和12.33 g/L，比優化前的對照初始培養基的6.63 g/L 和9.78 g/L，分別提高了16.89%和26.07%倍。

2.2 基于逐步回歸函數stepwise 的回歸建模

表3 葡萄糖與可溶性總糖二次多項式回歸系數顯著性檢驗

利用MATLAB R2018b 軟件包逐步回歸函數stepwise 建立培養基成分與發酵液中葡萄糖濃度與可溶性總糖濃度的二次多項式回歸模型（表3）

兩個方程的回歸系數顯著性檢驗表明：本試驗所選用的二次多項模型是極顯著性的(P＜0.01)，決定系數R2均為0.999，表明此模型擬合優度好，分別僅有約1%的變異不能由模型解釋。此外，除了小部分模型項之外（如X22），絕大部分模型項具有顯著性(P＜0.05)，并且均勻設計葡萄糖與可溶性總糖的實驗值和預測值的相對誤差均不超過2%（表2），由此充分說明采用二次多項式回歸模型對發酵液葡萄糖和可溶性總糖濃度進行預測的可行性和有效性。

2.2.4 模型求解與驗證

利用MATLAB 優化工具箱中的fmincon 函數求取葡萄糖和可溶性總糖的二次多項式回歸方程在自變量的取值范圍內的培養基最佳組合和相應的優化目標最佳預測值，結果發現：產葡萄糖的最佳培養基為（g/L）：酵母粉（X1），5.379；MgCl2·6H2O（X2），0.424；半胱氨酸鹽酸鹽（X3），0.996；K2HPO4·3H2O（X4），7.99；KH2PO4（X5），4.991；尿素（X6），1.171 和CaCl2·2H2O（X7），0.072，相應優化目標最佳預測值為8.559 g/L。產可溶性總糖的最佳培養基為（g/L）：酵母粉（X1），3.5；MgCl2·6H2O（X2），2.0；半胱氨酸鹽 酸 鹽（X3），0.788；K2HPO4·3H2O（X4），8.0；KH2PO4（X5），1.4；尿素（X6），4.0 和CaCl2·2H2O（X7），0.05，相應的優化目標最佳預測值為15.899 g/L。

在上述條件下進行發酵驗證，得出葡萄糖和可溶性總糖的濃度分別為9.00±1.05 g/L 和15.452±1.81 g/L，因此實驗值與預測值的誤差分別為5.15%和-2.89%，分別比均勻設計最高結果的7.75±0.87（即表2 中第1 號實驗）和12.332±1.39（即表2 中第9 號實驗）分別提高了16.13%和25.32%，比初始對照培養基的6.63±1.09 和9.78±1.02 分別提高了35.75%和58.0%。可見該模型能較好地預測實際發酵情況。且最優化條件下，熱纖梭菌發酵濾紙（20g/L），葡萄糖和可溶性總糖的得率分別為45%和77.26%。

2.3.5 可溶性總糖中纖維寡糖的HPLC 分析

在可溶性總糖最佳培養基驗證時，可溶性總糖濃度為15.452 g/L，測得葡萄糖含量為6.46 g/L，且用HPLC 測得纖維二糖、纖維三糖、纖維四糖和纖維五糖的濃度分別為3.172g/L、2.816g/L、1.593g/L 和1.162g/L，由于纖維二糖、纖維三糖、纖維四糖和纖維五糖的摩爾分子量分別為342.3、504.4、666.6 和828.7，因此熱纖梭菌發酵濾紙產生的寡糖相應的摩爾比率大致為9:5:2:1，也就是纖維寡糖產物，大部分為纖維二糖和纖維三糖。

3 結論

本文通過均勻設計和基于逐步回歸的二次多項式建模研究，優化了熱纖梭菌ATCC35609 發酵濾紙產葡萄糖和可溶性總糖的最佳培養基分別為（g/L）：酵母粉，5.379；MgCl2·6H2O，0.424；半胱氨酸鹽酸 鹽，0.996；K2HPO4·3H2O，7.99；KH2PO4，4.991；尿素，1.171；CaCl2·2H2O，0.072 和酵母粉，3.5；MgCl2·6H2O，2.0；半胱氨酸鹽酸鹽，0.788；K2HPO4·3H2O，8.0；KH2PO4，1.4；尿素，4.0；CaCl2·2H2O，0.05。結果不僅使濾紙的產葡萄糖和可溶性總糖的產率分別高達9.00 g/L 和15.452 g/L，且得率分別為45%和77.26%。還通過HPLC分析表明熱纖梭菌發酵濾紙產生的寡糖相應的摩爾比率大致為 9:5:2:1，且大部分為纖維二糖和纖維三糖，從而為利用熱纖梭菌發酵纖維素產纖維寡糖以開發相應的飼料添加劑奠定了實踐基礎。