高效液相色譜法測(cè)定紅香酥梨中6 種有機(jī)酸含量

李彩林，楊志國(guó)，王華瑞，李美萍

（1.山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品貯藏保鮮研究所，山西太原030031；2.山西大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山西太原030006）

紅香酥梨是由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院鄭州果樹(shù)研究所以庫(kù)爾勒香梨與鵝梨雜交選育而成的新梨品種，其果皮薄、汁多、肉脆、香甜可口，且豐產(chǎn)耐貯，因此，具有良好的發(fā)展前景[1-2]。果實(shí)中有機(jī)酸含量及種類(lèi)是決定果實(shí)內(nèi)在品質(zhì)的重要因素之一[3-4]，也是水果中主要的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)之一，它不僅對(duì)水果的口感、色澤及生物穩(wěn)定性有影響，而且可以促進(jìn)人們的食欲[5]，因此，研究紅香酥梨中有機(jī)酸種類(lèi)及含量對(duì)紅香酥梨的開(kāi)發(fā)和利用具有重要意義。

有機(jī)酸的測(cè)定方法有氫氧化鈉滴定法[6]、離子色譜法[7]、氣相色譜法[8]和高效液相色譜法[9]等。由于高效液相色譜法具有靈敏度高、準(zhǔn)確度好、操作簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)[10-11]，因此，其被廣泛應(yīng)用于棗[12]、蘋(píng)果[13]、藍(lán)莓[14]、楊梅[15]等水果中有機(jī)酸的檢測(cè)。孫延芳等[16]利用高效液相色譜法對(duì)酸棗中的有機(jī)酸和維生素C 含量進(jìn)行了檢測(cè)；關(guān)秀杰等[17]利用反相高效液相色譜法對(duì)火龍果中的6 種有機(jī)酸含量進(jìn)行了測(cè)定；胡志群等[18]測(cè)定了妃子笑和糯米滋2 個(gè)荔枝品種中有機(jī)酸、可溶性糖和維生素C 的含量變化；王琴飛等[19]建立了西番蓮中有機(jī)酸含量的高效液相色譜檢測(cè)方法；RODRIGO 等[20]對(duì)水果果汁中蘋(píng)果酸、酒石酸和Vc 進(jìn)行了檢測(cè)；馬倩倩等[21]對(duì)南疆地區(qū)駿棗和0604 酸棗果實(shí)中主要有機(jī)酸和Vc 進(jìn)行了定量分析。但目前關(guān)于紅香酥梨中有機(jī)酸含量測(cè)定尚未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道。

本試驗(yàn)旨在建立一種高效、快捷測(cè)定紅香酥梨中有機(jī)酸含量的方法，以期為紅香酥梨的品質(zhì)研究提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 材料 試驗(yàn)所用紅香酥梨采于山西省運(yùn)城市鹽湖區(qū)百忍堂農(nóng)場(chǎng)，采后立即運(yùn)回山西省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品貯藏保鮮研究所冷庫(kù)中（（-1.0±0.5）℃），挑選無(wú)病蟲(chóng)害、無(wú)腐爛、無(wú)機(jī)械損傷的紅香酥梨作為試驗(yàn)材料。

1.1.2 儀器設(shè)備與試劑 1200 高效液相色譜儀（美國(guó)Agilent 公司）配有四元泵、真空脫氣機(jī)、手動(dòng)進(jìn)樣器、柱溫箱、二極管陣列檢測(cè)器、色譜工作站；CAPECELL PAK MG S5 C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；Milli-Q Academic 超純水機(jī)（美國(guó)密理博公司）；AS10200AH 型超聲波清洗器（天津奧特賽恩斯儀器有限公司）；Allegra X-30R Centrifuge 高速冷凍離心機(jī)（美國(guó)貝克曼庫(kù)爾特公司）；SHA-C 水浴恒溫振蕩器（金壇市金城國(guó)勝實(shí)驗(yàn)儀器廠）；研缽；IMS-20 全自動(dòng)雪花制冰機(jī)（常熟市雪科電器有限公司）；Sartorius CP224S 電子分析天平（德國(guó)賽多利斯公司）；0.45 μm 微孔濾膜。

供試試劑為D- 蘋(píng)果酸、L- 蘋(píng)果酸、酒石酸、檸檬酸、琥珀酸、乳酸標(biāo)準(zhǔn)品（Sigma 公司）；甲醇（色譜純）；磷酸（分析純）、高純水。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 色譜條件 CAPECELLPAKMGS5 C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動(dòng)相為0.1%磷酸水溶液- 甲醇，其體積比為96∶4，等度洗脫；柱溫40 ℃，流速1 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)為210 nm；進(jìn)樣量20 μL。

1.2.2 有機(jī)酸標(biāo)準(zhǔn)品母液配制 分別精密稱(chēng)取D-蘋(píng)果酸、L- 蘋(píng)果酸、檸檬酸、乳酸各0.25 g 以及酒石酸0.125 g、琥珀酸0.625 g 于50 mL 燒杯中，加超純水溶解后轉(zhuǎn)移至50 mL 容量瓶中定容，制成D-蘋(píng)果酸、L- 蘋(píng)果酸、檸檬酸、乳酸、酒石酸、琥珀酸的標(biāo)準(zhǔn)貯備母液。

1.2.3 混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制 將1.2.2 配制好的標(biāo)準(zhǔn)貯備母液用0.1%磷酸水溶液依次稀釋成2.5，1.0，0.5，0.25，0.2，0.1，0.05，0.025，0.02，0.01，0.005 mg/mL的系列混標(biāo)溶液，將系列混標(biāo)溶液經(jīng)0.45 μm 微孔濾膜過(guò)濾（與樣品的色譜條件相同）后注入高效液相色譜儀中進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制。

1.2.4 樣品的處理 稱(chēng)取20 g 新鮮果肉，加入5 mL 0.1%的磷酸水溶液冰浴研磨成勻漿后轉(zhuǎn)入100 mL三角瓶中，用0.1%的磷酸水溶液多次沖洗研缽后將三角瓶置于35 ℃的混合振蕩器中振蕩30 min，再將其轉(zhuǎn)入50 mL 離心管中超聲波提取30 min，使有機(jī)酸充分浸出，冷卻后在4 ℃下以9 000 r/min 離心20 min，上清液過(guò)濾到50 mL 容量瓶中，用0.1%磷酸水溶液定容至刻度，待測(cè)液用0.45 μm 濾膜過(guò)濾后注入高效液相色譜儀中進(jìn)行分析。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)和分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

按照1.2.1 的色譜條件將不同濃度的系列混標(biāo)溶液依次進(jìn)樣，每個(gè)濃度重復(fù)3 次取其平均值，以峰面積（Y）對(duì)質(zhì)量濃度（X，mg/mL）求標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程和相關(guān)系數(shù)，結(jié)果列于表1。

表1 6 種有機(jī)酸對(duì)照品標(biāo)準(zhǔn)曲線方程

從表1 可以看出，6 種有機(jī)酸的相關(guān)系數(shù)均達(dá)到0.999 9，表明線性關(guān)系良好，說(shuō)明可以用此標(biāo)準(zhǔn)曲線來(lái)測(cè)定紅香酥梨中有機(jī)酸的含量。

2.2 有機(jī)酸標(biāo)準(zhǔn)品與紅香酥梨樣品高效液相色譜分析

取D- 蘋(píng)果酸、L- 蘋(píng)果酸、乳酸、檸檬酸、琥珀酸、酒石酸的混標(biāo)溶液進(jìn)樣，其色譜圖如圖1 所示。取紅香酥梨樣品提取液進(jìn)樣，其色譜圖如圖2 所示。

從圖1 可以看出，6 種有機(jī)酸標(biāo)準(zhǔn)品在此色譜條件下均得到良好的分離，且峰形良好，各組分的出峰順序依次為酒石酸、L- 蘋(píng)果酸、乳酸、檸檬酸、琥珀酸、D- 蘋(píng)果酸，其出峰時(shí)間分別為3.185，3.893，4.679，6.865，7.483，8.989 min。

由圖2 可知，紅香酥梨中含有D- 蘋(píng)果酸、L-蘋(píng)果酸、檸檬酸、琥珀酸、乳酸、酒石酸6 種有機(jī)酸，且各有機(jī)酸的分離度較好，其出峰時(shí)間分別是3.186，3.947，4.894，6.985，7.657，9.022 min。由此可以看出，待測(cè)樣品的出峰時(shí)間較標(biāo)準(zhǔn)品稍晚一些。

2.3 精密度檢測(cè)

按照1.2.1 的色譜條件將0.2 mg/mL 的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液連續(xù)進(jìn)樣5 次，考察該方法的精密度，根據(jù)峰面積計(jì)算酒石酸、L- 蘋(píng)果酸、乳酸、檸檬酸、琥珀酸、D- 蘋(píng)果酸的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD），其結(jié)果分別為1.31%，1.54%，2.64%，1.32%，0.77%，0.32%，表明該方法的精密度良好（表2）。

表2 精密度試驗(yàn)結(jié)果（n＝5）

2.4 重復(fù)性檢測(cè)

按1.2.4 的方法制備同一份紅香酥梨樣品5 份，在1.2.1 的色譜條件下進(jìn)行樣品分析，根據(jù)得到的峰面積計(jì)算各有機(jī)酸的重復(fù)性，得出D- 蘋(píng)果酸、L- 蘋(píng)果酸、檸檬酸、乳酸、酒石酸、琥珀酸的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）在0.66%～3.07% ，說(shuō)明該方法的重復(fù)性達(dá)到分析的要求（表3）。

表3 重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果（n＝5）

2.5 穩(wěn)定性檢測(cè)

表4 穩(wěn)定性試樣結(jié)果（n＝6）

取同一份紅香酥梨樣品貯備液，按照1.2.1 的色譜條件進(jìn)行測(cè)定，分別記錄樣品在貯藏0，2，4，6，8，12 h 下各有機(jī)酸的峰面積，從而判斷其穩(wěn)定性。結(jié)果顯示，酒石酸、L- 蘋(píng)果酸、乳酸、檸檬酸、琥珀酸、D- 蘋(píng)果酸的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD） 分別為1.44%，1.56%，3.21%，0.92%，3.93%，4.33%，說(shuō)明供試樣品在12 h 內(nèi)是穩(wěn)定的（表4）。

2.6 回收率測(cè)定

表5 6 種有機(jī)酸的回收率（n＝6）

取6 份體積相同且已知各有機(jī)酸含量的紅香酥梨樣品提取液，分別加入相同體積不同質(zhì)量濃度的有機(jī)酸對(duì)照品溶液，混合均勻后用0.45 μm 濾膜過(guò)濾，在1.2.1 的色譜條件下進(jìn)行樣品回收率試驗(yàn)，結(jié)果如表5 所示。結(jié)果顯示，各有機(jī)酸的回收率為96.00%～105.42%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為0.81%～4.68%，表明該方法準(zhǔn)確度較高。

2.7 紅香酥梨樣品中有機(jī)酸含量的測(cè)定

按1.2.4 方法對(duì)紅香酥梨樣品進(jìn)行處理，在1.2.1 的色譜條件下，測(cè)定紅香酥梨中各有機(jī)酸種類(lèi)與含量，每個(gè)樣品重復(fù)3 次，取平均值（表6）。

表6 紅香酥梨中有機(jī)酸含量測(cè)定結(jié)果

由表6 可知，紅香酥梨中以蘋(píng)果酸與檸檬酸為主要有機(jī)酸，且蘋(píng)果酸含量最多，為1 493.32 mg/kg，占到有機(jī)酸總量的71.16%；其次為檸檬酸（304.78 mg/kg），占到有機(jī)酸總量的14.52%；紅香酥梨中次要有機(jī)酸為琥珀酸與酒石酸，其含量分別為129.35，97.85 mg/kg，分別占到總有機(jī)酸含量的6.16%和4.66%；乳酸的含量則相對(duì)較低。

3 結(jié)論

本研究在CAPECELL PAK MG S5 C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），0.1%磷酸水溶液和甲醇作流動(dòng)相，柱溫40 ℃，流速1 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)210 nm，進(jìn)樣量20 μL 的色譜條件下能有效分離出紅香酥梨中6 種有機(jī)酸，并對(duì)其含量進(jìn)行了測(cè)定，其標(biāo)準(zhǔn)曲線相關(guān)系數(shù)均在0.999 9 以上，回收率為96.00%～105.42%，精密度、重復(fù)性、穩(wěn)定性的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）均在5%以?xún)?nèi)，表明該測(cè)定方法良好，且紅香酥梨中以蘋(píng)果酸與檸檬酸為主要有機(jī)酸，琥珀酸與酒石酸為次要有機(jī)酸，利用該方法對(duì)紅香酥梨中有機(jī)酸積累動(dòng)態(tài)及風(fēng)味特征的研究具有重要意義。