丙二醛氧化對籽瓜種仁蛋白質結構及功能特性的影響

高 瑾 Manonose - - 李志豪 -王 萍 余雄偉 - 李述剛 -

(1. 湖北工業大學生物工程與食品學院，湖北 武漢 430000；2. 塔里木大學生命科學學院，新疆 阿拉爾 843300；3. 武漢旭東有限公司，湖北 武漢 430000)

籽瓜(Citrulluslanatusvar)俗稱“打瓜”，是西瓜(Citrulluslanatus)的變種，為葫蘆科西瓜屬植物，其種子常被稱為西瓜子或黑瓜子。籽瓜種仁中蛋白質含量為36%～40%，其中必需氨基酸含量較為豐富，除賴氨酸外，其他幾種必需氨基酸(如色氨酸、苯丙氨酸等)含量均符合或超過FAO推薦的比例[1-2]。

丙二醛(Malondialdehyde，MDA)是一種活性醛類物質，能引起蛋白質、多糖、核酸等生命大分子的交聯反應形成聚合物，同時可通過MDA含量了解脂質過氧化程度[3]。籽瓜種仁在加工、儲藏等過程中極易受到光、氧、熱等影響而發生脂質過氧化，MDA是油脂氧化過程中的一種重要的氧化產物，對其產品風味、營養等會產生較大負面影響。籽瓜種子中油脂的含量為45%左右，亞油酸、棕櫚酸及硬脂酸是其主要成分[4]。籽瓜種仁蛋白質的研究主要集中在提取工藝、蛋白質組成及功能特性上[5]，而油脂氧化尤其是脂質氧化產物丙二醛對其蛋白質結構及功能性質方面的研究尚未見報道。

試驗擬以籽瓜種仁蛋白質為研究對象，采用圓二色光譜、質構等技術揭示MDA氧化對籽瓜種仁蛋白質的結構特性及功能特性的影響，為籽瓜種仁蛋白質產品在實際工業生產中的精加工提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

籽瓜種仁：產地新疆；

透析袋：8 000～14 000 Da，美國Biosharp公司；

1,1,3,3-四甲氧基丙烷(1,1,3,3-Tetramethoxypropane, TMP)、8-苯胺基-1-萘磺酸(8-Anilino-l-naphthalcncsulfonic acid, ANS)：分析純，美國Sigma公司。

1.1.2 儀器與設備

高速冷凍離心機：Micro 21R型，美國Thermo Fisher公司；

傅里葉紅外光譜儀：Nicoletis50型，美國Thermo Fisher公司；

圓二色譜儀：J-1500型，日本JASCO公司；

熒光分光光度計：F4600型，日本日立公司；

電泳儀：DYY-8C型，北京六一生物科技有限公司；

納米粒度分析儀：Nano ZS型，英國Malvern公司；

掃描電子顯微鏡：SU-8010型，日本日立公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 籽瓜蛋白的制備 參照毛曉英[6]的方法。

1.2.2 MDA的制備 通過水解1,1,3,3-四甲氧基丙烷(TMP)制備新鮮的MDA儲備溶液[7]。將8.4 mL TMP與10.0 mL 5.0 mol/L HCl和31.6 mL去離子水混合，40 ℃ 暗處搖晃30 min，獲得MDA，用6 mol/L NaOH將溶液pH調至7.4，儲備溶液中MDA濃度通過吸光度在267 nm 處估算，摩爾消光系數值為31 500 L/(mol·cm)。

1.2.3 氧化籽瓜種仁蛋白質的制備 參照Wu等[7]的方法，將一定量的MDA與籽瓜種仁蛋白質溶液(50 mg/mL)混合，MDA終濃度梯度為0.00，0.01，0.10，1.00，10.00，100.00 mmol/L，25 ℃密封避光條件下振蕩24 h，透析24 h后冷凍干燥，于4 ℃貯存備用。

1.2.4 巰基和二硫鍵含量的測定 采用DNTB比色法[8]。

1.2.5 表面疏水性的測定 采用ANS熒光探針法[8]。

1.2.6 二級結構的測定 參照Wu等[7]的方法，將籽瓜種仁蛋白質上清溶液稀釋成終濃度為50 μg/mL，利用MOS-450圓二色光譜儀進行檢測。

1.2.7 傅里葉紅外光譜分析 參考Liu等[9]的方法。在室溫、干燥環境下將2 mg氧化籽瓜種仁蛋白質樣品與200 mg KBr研磨混合均勻后壓片。掃描波數400～4 000 cm-1，分辨率4 cm-1，掃描次數128次。

1.2.8 聚丙烯酰胺凝膠電泳 參考Laemmli[10]的方法。將籽瓜種仁蛋白質樣品溶于0.01 mol/L pH 8.0 Tris-HCl緩沖液，使樣品最終濃度為1.5 mg/mL，上樣量10 μL。電泳凝膠板0.75 mm，初始電流10 mA，樣品進入分離膠后電流25 mA。

1.2.9 粒徑分布 參考Huang等[8]的方法。

1.2.10 微觀結構 參照張海華等[11]的方法，取少量籽瓜種仁蛋白質樣品過100目篩，采用掃描電子顯微鏡(SEM)進行觀察。

1.2.11 持水性和持油性的測定 參考吳偉等[12]的方法。

1.2.12 凝膠特性的檢測 利用超純水將氧化后的蛋白質配置成90 mg/mL蛋白溶液，根據前期預試驗調整布丁制作配方：0.25 g卡拉膠，0.09 g蔗糖脂肪酸酯，0.125 g果膠，4 g奶粉，3.5 g白砂糖，42.5 g氧化籽瓜種仁蛋白質溶液。將制作的布丁產品4 ℃下存放12 h后測其質構。測定模式為TPA模式[13]，探頭型號SMS/P36R，測前速率5.00 mm/s，測試速率1 mm/s，測后速率1 mm/s，停留時間10 s，下壓形變40%，觸發力5 g。

1.3 數據處理

試驗結果表示為(平均值±標準偏差)，采用SPSS 17.0分析軟件對數據進行顯著性分析，利用Origin 2017軟件繪圖。

2 結果與分析

2.1 巰基和二硫鍵含量

由表1可知，隨MDA濃度的增加，籽瓜種仁蛋白質總巰基含量下降，二硫鍵含量上升，可能是蛋白質氨基酸側鏈在MDA作用下形成共價交聯，導致巰基含量損失，二硫鍵數量及分布改變，與Wu等[4]的研究結果類似。因此，MDA氧化后的籽瓜種仁蛋白質結構發生變化。

2.2 表面疏水性

由圖1可知，籽瓜種仁蛋白質表面疏水性隨MDA終濃度的增大而減小(P<0.05)，可能是蛋白質構象在MDA氧化作用下先展開后又重新組合，導致親水基團增加，疏水基團減少或者是蛋白質聚集，掩埋疏水基團，使其含量下降。王丹丹等[14]研究表明，核桃蛋白表面疏水性隨氧化程度的加深逐漸降低。

2.3 圓二色光譜

由表2可知，氧化后的籽瓜種仁蛋白質的α-螺旋含量減少，β-折疊含量上升，β-轉角及無規則卷曲含量下降，蛋白質的二級結構主要由氨基酸的局部序列和分子間不同部位的相互作用決定[15]，上述結果表明氧化會在一定程度上破壞籽瓜種仁蛋白質分子間的相互作用，進而改變二級結構。

表1不同濃度MDA氧化對籽瓜種仁蛋白質總巰基及二硫鍵含量的影響?

Table 1 Effects of MDA oxidation at different concentrations on the content of total sulfydryl group and disulfide bond of seeds-watermelon seed protein

MDA濃度/(mmol·L-1)總巰基/(Cund·mg-1)二硫鍵/(Cund·mg-1)0.0048.02±0.73d18.56±0.37a0.0146.06±0.50c19.55±0.25b0.1044.57±1.06b20.29±0.53c1.0043.20±0.94b20.98±0.47c10.0041.18±0.24b21.98±0.45c100.0039.70±0.18a22.73±0.39d

? 字母不同表示差異顯著(P<0.05)。

字母不同表示差異顯著(P<0.05)

Figure 1 Effects of MDA oxidation at different concentrations on surface hydrophobicity of seeds-watermelon seed protein

表2 不同濃度MDA氧化對籽瓜種仁蛋白質二級結構的影響?

? 字母不同表示差異顯著(P<0.05)。

2.4 傅里葉紅外光譜

2.5 凝膠電泳

由圖3可知，在非還原情況下，35～260 kDa的條帶濃度隨MDA濃度的升高而增加；在MDA濃度為100.00 mmol/L時，高分子量聚集體在凝膠頂端發生積聚且逐漸加深，表明籽瓜種仁蛋白質受到氧化而產生聚集，且聚集程度隨蛋白質氧化程度的加深而不斷增加。Chen等[17]研究也發現，油脂氧化產物作用于大豆分離蛋白可導致非二硫鍵誘導的聚集產生，并認為這種聚集是由非二硫鍵的共價鍵引起的。因此，籽瓜種仁蛋白質在氧化過程中，分子量的改變也會對其結構產生影響，進而改變蛋白質的功能特性。

圖2 不同濃度MDA氧化籽瓜種仁蛋白質的傅里葉紅外光譜分析

Figure 2 Fourier infrared spectrum analysis of seeds-watermelon seed protein oxidized by MDA at different concentrations

2.6 粒徑分布

由圖4可知，MDA氧化與天然的籽瓜種仁蛋白質粒徑均呈單峰分布，峰值大多出現在 100.00 nm左右；當MDA濃度為1.00 mmol/L時，粒徑增大至150 nm，可能是低濃度氧化誘使籽瓜種仁蛋白質形成了氧化聚集體，蛋白質粒徑分布增大；當MDA濃度為100.00 mmol/L時，籽瓜種仁蛋白質溶液中一些較大的可溶性聚集體在共價和非共價鍵的直接相互作用下轉變成不溶性組分，小的可溶性聚集體斷裂為更小的小分子多肽，將氧化后的籽瓜種仁蛋白質溶液離心后，其粒徑減小。由此表明MDA氧化促使籽瓜種仁蛋白質發生聚集，不可溶性蛋白質組分含量提高，蛋白質溶解度降低。

1. 蛋白Marker 2～7. 分別為100.00，10.00，1.00，0.10，0.01，0.00 mmol/L MDA氧化后的籽瓜種仁蛋白樣品

圖3 經不同濃度MDA氧化后籽瓜種仁蛋白質凝膠電泳圖

Figure 3 Protein gel electrophoresis of seeds-watermelon seed protein after MDA oxidation at different concentrations

圖4 不同濃度MDA氧化籽瓜種仁蛋白粒徑分析

Figure 4 Particle size analysis of seeds-watermelon seed protein oxidized by MDA at different concentrations

2.7 微觀結構

由圖5可知，未氧化的籽瓜種仁蛋白質顯示出比較致密的結構，氧化后的結構較為疏松，且隨MDA濃度的增大出現較多的顆粒狀結構，可能是籽瓜種仁蛋白質的高級結構在氧化后會發生去折疊，分子間聚集，從而使表面結構改變[18]。

圖5 不同濃度MDA氧化籽瓜種仁蛋白質的微觀結構

Figure 5 The microstructure of seeds-watermelon seed protein oxidized by MDA at different concentrations

2.8 持水性

由圖6可知，籽瓜種仁蛋白質的持水性隨MDA濃度的增大先下降后上升，但均高于天然籽瓜種仁蛋白質的。當MDA濃度較低時，籽瓜種仁蛋白質表面氨基酸殘基與MDA接觸并反應，使得籽瓜種仁蛋白質部分去折疊，疏水基團外露，持水性下降；隨著MDA濃度的增大，籽瓜種仁蛋白質內部氨基酸殘基被氧化修飾形成聚集體，水分子進入球蛋白內部，使持水性得到提高。故籽瓜種仁蛋白質在氧化后，其結構發生改變，而適度氧化有利于提高蛋白質的持水性，為其生產加工及儲藏方面提供理論支撐。

字母不同表示差異顯著(P<0.05)

Figure 6 Effects of MDA oxidation at different concentrations on water-holding capacity of seeds-watermelon seed protein

2.9 持油性

由圖7可知，籽瓜種仁蛋白質持油性隨MDA氧化程度的增加先上升后下降，在MDA濃度為0.10 mmol/L時達最大。Wu等[7]研究發現MDA可與大豆分離蛋白內部氨基酸殘基接觸、反應，暴露疏水基團。因而，不同濃度MDA氧化使得籽瓜種仁蛋白質對油脂的吸附能力增加，但當MDA濃度較高時，籽瓜種仁蛋白質在MDA的作用下共價交聯度增加，與油脂結合能力下降，導致持油性略微降低。故MDA氧化對籽瓜種仁蛋白質的持油性有一定的促進作用，可提高產品的風味品質。

2.10 凝膠特性的分析

由表3可知，籽瓜種仁蛋白質凝膠的硬度、咀嚼性隨MDA濃度增大而減小，彈性在MDA濃度為0.10 mmol/L最好，恢復性變化不明顯。這可能是籽瓜種仁蛋白質在加熱條件下發生變性，其蛋白質結構展開并發生分子間交聯，進而聚集形成凝膠[19]。因此，MDA氧化可在一定程度上破壞籽瓜種仁蛋白質凝膠特性的形成，進而影響其生產應用。

字母不同表示差異顯著(P<0.05)

Figure 7 Effects of MDA oxidation at different concentrations on oil-holding capacity of seeds-watermelon seed protein

表3 不同濃度MDA氧化對籽瓜種仁蛋白質凝膠特性的影響?

? 字母不同表示差異顯著(P<0.05)。

3 結論

隨著MDA濃度的升高，氧化程度加劇，籽瓜種仁蛋白質結構由無序變為有序，出現明顯的聚集現象；MDA氧化在一定程度上可提高籽瓜種仁蛋白質的持水性及持油性，而其凝膠特性逐漸被破壞，因此，不同濃度梯度MDA對籽瓜種仁蛋白質的凝膠特性會產生負面影響，進而影響其在凝膠加工過程中的應用。脂質過氧化反應較為復雜，代謝副產物較多，MDA為主要次生產物之一，脂質過氧化對籽瓜種仁蛋白質的影響機理有待進一步探討。