錦龜酯酶與樹(shù)鼩酯酶對(duì)部分有機(jī)磷和氨基甲酸酯類農(nóng)藥的敏感性研究

宋燕飛 - 陳祥貴 - 向俊丞 -王 瑋 陰鵬飛 - 楊 瀟

(1. 西華大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，四川 成都 610039；2. 宜賓西華大學(xué)研究院，四川 宜賓 644004；3. 西華大學(xué)食品非熱加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 宜賓 644004；4. 西華大學(xué)食品非熱加工工程技術(shù)研究中心，四川 宜賓 644004)

農(nóng)藥殘留一直是各國(guó)食品安全體系建設(shè)重點(diǎn)關(guān)注的內(nèi)容[1]。中國(guó)是一個(gè)農(nóng)業(yè)大國(guó)，農(nóng)藥使用十分廣泛且管理困難，迫切需要發(fā)展適合基層監(jiān)測(cè)監(jiān)管的農(nóng)藥殘留快速檢測(cè)手段[2-3]。因此，采取及時(shí)、有效、快速的檢測(cè)方法對(duì)農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全進(jìn)行監(jiān)管顯得尤為重要。

在現(xiàn)有的農(nóng)藥殘留檢測(cè)中，氣相色譜法[4]、氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法[5-6]、高效液相色譜法[7-8]和液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用法[9-10]作為傳統(tǒng)的手段，可以有效檢測(cè)出果蔬中的農(nóng)藥殘留量，但檢測(cè)成本高、耗時(shí)長(zhǎng)、不利于快速檢測(cè)。而酶抑制法作為一種體外檢測(cè)農(nóng)藥殘留量的新型方法，具有操作簡(jiǎn)便、快速、靈敏度高、無(wú)需昂貴的儀器等特點(diǎn)，特別適合基層現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)，是目前農(nóng)藥殘留快速檢測(cè)常用的方法[11]。

酶抑制法中，檢測(cè)用酶是影響酶抑制法靈敏性和準(zhǔn)確性的關(guān)鍵因素。國(guó)內(nèi)外報(bào)道[12-14]用于農(nóng)藥殘留檢測(cè)的酶?jìng)鞲衅魉妹附^大多數(shù)為乙酰膽堿酯酶(acetylcholinesterase，AChE)，且主要來(lái)自電鰻、家蠅和牛紅細(xì)胞，酶源非常單一。課題組[15]前期研究中通過(guò)同源建模和分子對(duì)接預(yù)測(cè)各種酯酶對(duì)不同農(nóng)藥的敏感性，該方法在預(yù)測(cè)絲氨酸水解酶對(duì)有機(jī)磷農(nóng)藥的敏感性方面表現(xiàn)出良好的性能，發(fā)現(xiàn)錦龜頭部酯酶和樹(shù)鼩肝部酯酶具有較高的應(yīng)用前景。試驗(yàn)擬以錦龜頭部酯酶和樹(shù)鼩肝部酯酶為研究對(duì)象，確定酶促反應(yīng)的最佳檢測(cè)條件，測(cè)定兩種酶對(duì)常見(jiàn)有機(jī)磷類農(nóng)藥和氨基甲酸酯類農(nóng)藥的IC50和LOD值，為科學(xué)評(píng)價(jià)以錦龜酯酶、樹(shù)鼩酯酶為酶源在酶抑制法中的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

錦龜頭部、樹(shù)鼩肝部粗酶：保存于-20 ℃，中國(guó)科學(xué)院昆明動(dòng)物研究所；

敵敵畏、敵百蟲(chóng)、氧化樂(lè)果、速滅磷、甲胺磷、對(duì)硫磷、樂(lè)果、磷銨、久效磷、毒死蜱、辛硫磷、克百威、速滅威、甲萘威、滅多威、涕滅威、丁硫克百威：國(guó)家農(nóng)藥質(zhì)檢中心；

碘化硫代乙酰膽堿(ATChI)、5,5’-二硫代-2,2’-二硝基苯甲酸(DTNB)、吲哚乙酸酯(3-Acetoxyindole)：分析純，美國(guó)Fluka公司；

其他試劑：分析純，美國(guó)Sigma公司。

1.2 儀器與設(shè)備

多功能酶標(biāo)儀：SpectraMax i3x型，美國(guó)Molecular Devices公司；

電子天平：TB-214型，北京賽多利斯儀器有限公司；

超低溫冰箱：Ultra Freeze3410型，丹麥Heto公司。

1.3 錦龜乙酰膽堿酯酶與樹(shù)鼩酯酶的相對(duì)酶活測(cè)定

1.3.1 錦龜乙酰膽堿酯酶 根據(jù)Ellman法[16]測(cè)定并稍作修改。依次取50 μL磷酸緩沖液(0.1 mol/L，pH 7.5)、50 μL 錦龜酶液、100 μL ATChI (1.5 mmol/L)加入96孔板，35 ℃下處理15 min，加入100 μL DTNB(1.5 mmol/L)顯色，通過(guò)在412 nm處連續(xù)測(cè)量5 min內(nèi)OD值的變化來(lái)檢測(cè)相對(duì)酶活。同時(shí)以酶抑制法常用酶源電鰻乙酰膽堿酯酶在最適條件下的相對(duì)酶活作為對(duì)照酶活[17]。按式(1)計(jì)算錦龜酯酶相對(duì)酶活。

(1)

式中：

c——相對(duì)酶活，%；

m1——錦龜OD值變化；

m2——電鰻OD值變化。

1.3.2 樹(shù)鼩酯酶 根據(jù)酶片法[18]測(cè)定并稍作修改。分別取100 μL磷酸鹽緩沖液(0.1 mol/L，pH 8.0)、50 μL樹(shù)鼩肝臟酶液加入96孔板，25 ℃下孵育15 min，加入50 μL 吲哚乙酸酯(8 mmol/L)，通過(guò)5 min內(nèi)連續(xù)測(cè)量610 nm處熒光強(qiáng)度的變化來(lái)檢測(cè)相對(duì)酶活。同時(shí)以酶抑制法常用酶源豬肝酯酶在最適條件下的相對(duì)酶活作為對(duì)照酶活[17]。按式(2)計(jì)算樹(shù)鼩酯酶的相對(duì)酶活。

(2)

式中：

c——相對(duì)酶活，%；

m1——樹(shù)鼩酯酶的熒光值變化；

m2——豬肝酯酶的熒光值變化。

1.4 酯酶抑制率的檢測(cè)

在酶促反應(yīng)體系中，分別加入不同濃度的酶抑制劑，同時(shí)以未加抑制劑組為對(duì)照組。分別按1.3的方法測(cè)定相對(duì)酶活，并按式(3)計(jì)算抑制率。

(3)

式中：

c——抑制劑，%；

m1——無(wú)抑制時(shí)反應(yīng)體系OD值；

m2——有抑制時(shí)反應(yīng)體系OD值。

1.5 錦龜酯酶與樹(shù)鼩酯酶酶促反應(yīng)條件的優(yōu)化

1.5.1 pH、溫度和反應(yīng)時(shí)間對(duì)酶促反應(yīng)的影響 在溫度35 ℃，反應(yīng)時(shí)間15 min下，考察pH(6.5，7.0，7.5，8.0，8.5)對(duì)相對(duì)酶活的影響；在pH 7.5，反應(yīng)時(shí)間15 min下，考察溫度(20，25，30，35，40 ℃)對(duì)相對(duì)酶活的影響；在溫度35 ℃，pH 7.5下，考察反應(yīng)時(shí)間(5，10，15，20，25 min)對(duì)相對(duì)酶活的影響。

1.5.2 正交試驗(yàn) 在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選取最適pH值、溫度、時(shí)間設(shè)計(jì)三因素三水平正交試驗(yàn)，優(yōu)化酶促反應(yīng)條件。

1.6 農(nóng)藥敏感性(IC50)研究

按1.4方法測(cè)量錦龜酯酶和樹(shù)鼩酯酶抑制率，根據(jù)不同農(nóng)藥濃度(2×10-3，2×10-4，2×10-5，2×10-6，2×10-7，2×10-8mol/L)的酶抑制率C，以抑制劑濃度負(fù)對(duì)數(shù)(-lgC)為橫坐標(biāo)，抑制率為縱坐標(biāo)，繪制折線圖，通過(guò)抑制率曲線方程，當(dāng)y=0.5時(shí)，抑制率為50%，計(jì)算得到IC50。

1.7 數(shù)據(jù)處理

采用Origin 8、SPSS 16.0和Excel等分析軟件對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 pH、溫度、反應(yīng)時(shí)間對(duì)酶活力的影響

由圖1可知，錦龜酯酶最佳反應(yīng)條件為pH 7.5、溫度35 ℃、反應(yīng)時(shí)間15 min；樹(shù)鼩酯酶最佳反應(yīng)條件為pH 8.0、溫度25 ℃、反應(yīng)時(shí)間15 min。

2.2 最優(yōu)反應(yīng)條件確定

2.2.1 錦龜酯酶 根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果選擇適宜參數(shù)水平，建立三因素三水平正交試驗(yàn)因素水平表見(jiàn)表1，正交試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2，方差分析見(jiàn)表3。

圖1 反應(yīng)條件對(duì)酶活的影響

由表2、3可知，各因素對(duì)錦龜酯酶酶活影響次序?yàn)閜H >溫度>反應(yīng)時(shí)間，且三者對(duì)酶活的影響均極顯著，其中pH對(duì)酶活測(cè)定影響最大；最佳反應(yīng)條件為A2B2C2，即pH 7.5、溫度35 ℃、反應(yīng)時(shí)間15 min。驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)(n=9)測(cè)得，該條件下相對(duì)酶活為(108.440±0.176)%。

表1 錦龜酯酶酶促反應(yīng)條件正交試驗(yàn)因素設(shè)計(jì)水平表

表2 錦龜酯酶酶促反應(yīng)條件正交試驗(yàn)及結(jié)果

表3 方差分析表?

2.2.2 樹(shù)鼩酯酶 根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果選擇適宜參數(shù)水平，建立三因素三水平正交試驗(yàn)因素水平表，見(jiàn)表4，正交試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表5，方差分析見(jiàn)表6。

由表4、5可知，各因素對(duì)樹(shù)鼩酯酶影響大小為溫度>pH>反應(yīng)時(shí)間，pH、溫度對(duì)樹(shù)鼩酯酶影響差異極顯著；樹(shù)鼩酯酶最佳反應(yīng)條件為A2B2C2，即pH 8.0、溫度25 ℃、時(shí)間15 min。驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)(n=9)測(cè)得,該條件下相對(duì)酶活為(113.569±0.351)%。

表4 樹(shù)鼩酯酶酶促反應(yīng)條件正交試驗(yàn)因素設(shè)計(jì)水平表

表5 樹(shù)鼩酯酶酶促反應(yīng)條件正交試驗(yàn)及結(jié)果

表6樹(shù)鼩酯酶酶促反應(yīng)條件方差分析表?

Table 6 Variance analysis of enzymatic reaction conditions of esterase from Tupaiabelangeri

2.3 特異性抑制分析

由圖2(a)可知，當(dāng)鹽酸多奈哌齊、毒扁豆堿濃度分別為10-3，10-4mol/L 時(shí)，錦龜提取酶抑制率基本達(dá)到100%；當(dāng)濃度分別為10-5，10-6mol/L 時(shí)，抑制率下降，但抑制率>70%；當(dāng)雙(4-硝基苯基)磷酸酯濃度為10-3mol/L 時(shí)，抑制率為56.32%，但在10-4，10-5，10-6mol/L 時(shí)，抑制率均<20%；錦龜提取酶對(duì)3種酶抑制劑的敏感性順序?yàn)辂}酸多奈哌齊>毒扁豆堿>雙(4-硝基苯基)磷酸酯，表明錦龜頭部提取的粗酶中可能主要為AChE酶。

由圖2(b)可知，當(dāng)抑制劑濃度為10-3，10-4mol/L 時(shí)，雙(4-硝基苯基)磷酸酯、毒扁豆堿對(duì)樹(shù)鼩提取酶抑制率均≥94%，當(dāng)抑制濃度為10-5，10-6mol/L時(shí)，抑制率下降，但抑制率>70%；樹(shù)鼩酶對(duì)3種酶抑制劑的敏感性順序?yàn)殡p(4-硝基苯基)磷酸酯>毒扁豆堿>鹽酸多奈哌齊，表明樹(shù)鼩肝部提取的粗酶中可能主要為酯酶。

2.4 對(duì)不同濃度有機(jī)磷類、氨基甲酸酯類農(nóng)藥的敏感性

由圖3可知，隨著農(nóng)藥濃度的降低，5種有機(jī)磷農(nóng)藥對(duì)錦龜酯酶、樹(shù)鼩酯酶的抑制率逐漸降低。當(dāng)農(nóng)藥終濃度由10-4mol/L下降到10-9mol/L時(shí)，錦龜酯酶抑制率下降最明顯的是速滅磷和辛硫磷，下降了68%；樹(shù)鼩酯酶抑制率中，敵敵畏、敵百蟲(chóng)、速滅磷、磷胺、辛硫磷分別下降了52%，61%，57%，59%，74%。

圖3 有機(jī)磷農(nóng)藥對(duì)酶的抑制效果

由圖4可知，5種氨基甲酸酯類農(nóng)藥對(duì)錦龜酯酶、樹(shù)鼩酯酶抑制率都較高。當(dāng)農(nóng)藥終濃度由10-4mol/L 下降到10-9mol/L時(shí)，5種氨基甲酸酯類農(nóng)藥對(duì)錦龜酯酶抑制率隨農(nóng)藥濃度降低逐漸降低，下降率最高的為克百威，下降了74%；而樹(shù)鼩酯酶中下降率最高的為速滅威，下降了73%。

圖4 氨基甲酸酯類農(nóng)藥對(duì)酶的抑制效果

表7 酶對(duì)有機(jī)磷類和氨基甲酸酯類農(nóng)藥的IC50

3 結(jié)論

試驗(yàn)表明，錦龜酯酶酶活的最佳反應(yīng)條件為孵育溫度35 ℃、孵育時(shí)間15 min、緩沖液pH 7.5；樹(shù)鼩酯酶酶活的最佳反應(yīng)條件為孵育溫度25 ℃、孵育時(shí)間15 min、緩沖液pH 8.0。抑制劑敏感性試驗(yàn)表明錦龜粗酯酶中主要為乙酰膽堿酯酶，而樹(shù)鼩肝部提取的粗酶中主要酯酶為酯酶。而錦龜酯酶和樹(shù)鼩酯酶對(duì)常見(jiàn)有機(jī)磷和氨基甲酸酯類農(nóng)藥的敏感性均較高，且用于酶抑制法的LOD值均小于GB 2763—2019所要求的農(nóng)藥最大殘留量限量。目前乙酰膽堿酯酶主要從家蠅、電鰻中提取，來(lái)源較少，難以滿足檢測(cè)過(guò)程中的需求，試驗(yàn)所選用兩種酶源，對(duì)多數(shù)有機(jī)磷農(nóng)藥和氨基甲酸酯類農(nóng)藥敏感性較好，可作為酶抑制法快速檢測(cè)農(nóng)藥殘留的候選酶源。試驗(yàn)中僅將粗酶作為試驗(yàn)用酶，為進(jìn)一步揭示錦龜酯酶和樹(shù)鼩酯酶對(duì)農(nóng)藥的敏感性，下一步可先將錦龜酯酶和樹(shù)鼩酯酶純化，再分析其對(duì)農(nóng)藥的敏感性。