液相色譜—串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定番茄和黃瓜中敵菌靈殘留量

陳景春 -

(上海必諾檢測(cè)技術(shù)服務(wù)有限公司，上海 201114)

敵菌靈化工產(chǎn)品學(xué)名2,4-二氯-6-(鄰氯代胺基)均三氮苯，由三聚氰酰氯與鄰氯苯胺在脫酸劑存在下作用而得到的一種殺菌劑，外觀為白色至黃色結(jié)晶，熔點(diǎn)159～160 ℃，能溶于鏈烴類和其他多數(shù)有機(jī)試劑，如甲苯、二甲苯、丙酮等(在堿性介質(zhì)中30 ℃以下即可分解)[1-2]。敵菌靈具有低毒、內(nèi)吸性和殺菌譜較廣等特點(diǎn)[3]，主要用于防治瓜類中常見的黑星病、炭疽病、霜霉病，水稻中的稻瘟病、胡麻葉斑病、煙草赤星病，番茄斑枯病以及各種農(nóng)作物中常見的灰霉病等。

農(nóng)藥在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)過程中無可避免地被使用，對(duì)環(huán)境和生物鏈均有極大的破壞性，而水果、蔬菜上的農(nóng)藥殘留問題也是由來已久的，已經(jīng)對(duì)人體健康和生命安全造成了嚴(yán)重的威脅[4]。隨著人類對(duì)農(nóng)藥殘留問題的日益重視，日本、美國及歐盟國家都制定了相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)，規(guī)定了在水果、蔬菜和糧食中的最大殘留限量值，并對(duì)其殘留量進(jìn)行監(jiān)測(cè)。日本農(nóng)藥注冊(cè)保留標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定果品(草莓除外)、蔬菜、甜菜等敵菌靈最大殘留量(MRL)值為10 mg/kg、草莓為20 mg/kg，中國在GB 2763—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中農(nóng)藥最大殘留限量》中規(guī)定了敵菌靈在黃瓜和番茄中的最大殘留量(MRL)值為10 mg/kg。

農(nóng)藥殘留分析的樣品種類繁多，化學(xué)組成復(fù)雜，要使分析儀器能檢測(cè)到痕量的殘留農(nóng)藥，需對(duì)樣品進(jìn)行必要的提取、濃縮和凈化處理[5-6]。固相萃取是近年發(fā)展起來的一種樣品預(yù)處理技術(shù)，由液固萃取和液相色譜柱技術(shù)相結(jié)合發(fā)展而來，能有效地將分析物與干擾組分分離，減少樣品預(yù)處理過程，操作簡單、省時(shí)、省力，現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于農(nóng)藥殘留的分析中[7]。目前，測(cè)定蔬菜、水果中敵菌靈農(nóng)藥殘留量的檢測(cè)文獻(xiàn)和標(biāo)準(zhǔn)方法主要集中在高效液相色譜法[8-10]和氣質(zhì)聯(lián)用法[11-12]等，但液相色譜及氣質(zhì)聯(lián)用法在實(shí)際使用中，存在靈敏度較低，選擇性較差、分子離子峰難以識(shí)別、不能準(zhǔn)確區(qū)分干擾物及目標(biāo)物等缺點(diǎn)，文獻(xiàn)[12]使用液相色譜—質(zhì)譜聯(lián)用法檢測(cè)敵菌靈但并未對(duì)樣品進(jìn)行凈化及濃縮。

試驗(yàn)擬通過固相萃取進(jìn)行凈化，結(jié)合高效液相色譜—串聯(lián)質(zhì)譜高選擇性、高靈敏性的優(yōu)勢(shì)，對(duì)組分復(fù)雜的樣品進(jìn)行實(shí)時(shí)分析，以期能夠提供精準(zhǔn)的目標(biāo)物結(jié)構(gòu)信息、相對(duì)分子質(zhì)量等信息，為判定目標(biāo)物提供依據(jù)。

1 試驗(yàn)部分

1.1 試驗(yàn)設(shè)備

電子分析天平：BP211D型，德國Sartorius公司；

高效液相色譜—質(zhì)譜聯(lián)用儀：Agilent 1290+6470型，美國安捷倫公司；

高速冷凍離心機(jī)：Sovall ST16R型，美國賽默飛世爾公司；

漩渦振蕩器：Basic Vortex Mixer型，美國Talboys公司；

氮吹儀：DC-24型，上海安譜實(shí)驗(yàn)室科技股份有限公司。

1.2 材料與試劑

番茄、黃瓜：購自上海大潤發(fā)超市；

乙腈、正己烷、甲醇、丙酮、甲酸：色譜純，美國Sigma公司；

氯化鈉：分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；

敵菌靈標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)：(99.0±1.0)%，德國Dr. Ehrenstorfer公司；

弗羅里硅土(Florisil)固相萃取柱：500 mg/6 mL，美國Waters公司。

1.3 樣品提取及凈化

準(zhǔn)確稱取粉碎均勻的樣品10 g(精確到0.01 g)于50 mL 離心管中，準(zhǔn)確加入20 mL乙腈溶液，用高速勻漿機(jī)均質(zhì)1 min，加入3～5 g氯化鈉于離心管中，蓋上瓶蓋，于渦旋振蕩器上劇烈振蕩5 min。在4 ℃條件下，以8 000 r/min 離心10 min，移取乙腈層至圓底燒瓶中，殘?jiān)?0 mL乙腈反復(fù)提取1次，合并乙腈層，于40 ℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至近干，加入3.0 mL正己烷振蕩溶解，待凈化。

依次使用3 mL正己烷—丙酮溶液(體積比85∶15)和正己烷分別預(yù)淋洗弗羅里硅土固相萃取柱，待正己烷接近流盡時(shí)，加入待凈化液， 用50 mL梨形瓶接收洗脫液，用15 mL正己烷—丙酮溶液(體積比85∶15)分3次沖洗圓底燒瓶后過弗羅里硅土固相萃取柱，收集洗脫液，在40 ℃條件下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至近干。用1 mL甲醇溶液溶解，經(jīng)0.22 μm有機(jī)相濾膜過濾，待上質(zhì)譜分析。

1.4 液相及質(zhì)譜分析條件

1.4.1 液相部分 色譜柱：Infinitylab Poroshell 120 EC-C18(2.7 μm，3.0 mm ×100 mm)；流動(dòng)相：A為甲醇，B為0.1%甲酸水溶液(流動(dòng)相梯度洗脫條件具體見表1)；流動(dòng)相流速：0.4 mL/min；進(jìn)樣量：5 μL；色譜柱溫：40 ℃。

1.4.2 質(zhì)譜部分 離子源類型：電噴霧離子源(ESI)；離子源溫度：150 ℃；電噴霧電壓：1.2 kV；毛細(xì)管電壓：3 500 V；

表1 流動(dòng)相梯度洗脫條件

掃描方式及監(jiān)測(cè)方式分別為正離子掃描及多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)；干燥氣溫度：350 ℃，干燥氣流量：11 L/min；去溶劑氣流量：11 L/min；去溶劑氣溫度：350 ℃；霧化氣壓力：172 kPa；在正離子掃描模式下，直接進(jìn)樣敵菌靈標(biāo)準(zhǔn)溶液并進(jìn)行母離子全掃描，確定以分子離子m/z275為母離子，然后對(duì)其進(jìn)行子離子掃描，得到2個(gè)監(jiān)測(cè)離子分別為153和214，并且通過調(diào)節(jié)毛細(xì)管電壓，錐孔電壓及碰撞能量等，優(yōu)化質(zhì)譜參數(shù)，并得到最終結(jié)果。具體數(shù)值見表2。

表2 敵菌靈的多反應(yīng)監(jiān)測(cè)質(zhì)譜參數(shù)

1.5 標(biāo)準(zhǔn)貯備液及標(biāo)準(zhǔn)工作曲線繪制

準(zhǔn)確稱取敵菌靈農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)品，用甲醇定容，得到濃度為1 mg/mL標(biāo)準(zhǔn)貯備液，并置于4 ℃冰箱保存。分別吸取適量敵菌靈農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)貯備液，用甲醇稀釋成標(biāo)準(zhǔn)工作液，在空白基質(zhì)中分別添加0.1，0.5，1.0，2.0，5.0，10.0 μg的敵菌靈標(biāo)準(zhǔn)溶液，按樣品同樣處理后上機(jī)測(cè)定，得到敵菌靈的標(biāo)準(zhǔn)工作曲線。敵菌靈標(biāo)準(zhǔn)品圖譜見圖1。

圖1 敵菌靈標(biāo)準(zhǔn)品圖譜

1.6 樣品提取溶劑的選擇

根據(jù)化學(xué)性質(zhì)，敵菌靈易溶于甲醇、乙腈、丙酮等多數(shù)有機(jī)試劑，在水中幾乎不溶解[1-2]。試驗(yàn)選取了3種在農(nóng)藥殘留檢測(cè)中常用且極性各不相同的提取試劑：乙酸乙酯、丙酮和乙腈。通過在空白基質(zhì)中添加敵菌靈標(biāo)準(zhǔn)品，并使用這3種試劑進(jìn)行提取，測(cè)定其樣品回收率。

1.7 凈化固相萃取柱的選擇

凈化是樣品前處理部分的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，選取合適的固相萃取柱能夠有效地去除基質(zhì)中的雜質(zhì)，縮短凈化時(shí)間，有效富集被測(cè)物，大大提高檢測(cè)的靈敏度。方法選擇GCB固相萃取柱及Florisil柱進(jìn)行比對(duì)，通過添加敵菌靈標(biāo)準(zhǔn)溶液，經(jīng)過固相萃取柱凈化后，測(cè)定其回收率，對(duì)其進(jìn)行比較。

1.8 凈化固相萃取柱的選擇

于15 mL試管中加入適量的敵菌靈標(biāo)準(zhǔn)工作液，氮吹至近干后，加入3 mL正己烷溶解，渦旋混和均勻，通過預(yù)淋洗完的Florisil柱，分別用5，10，15，20 mL 4種不同用量的正己烷—丙酮溶液(體積比85∶15)進(jìn)行洗脫，同時(shí)收集洗脫液，40 ℃條件下氮吹至近干，用1 mL甲醇溶解，經(jīng)0.22 μm有機(jī)相濾膜過濾，上機(jī)分析。

1.9 基質(zhì)效應(yīng)的評(píng)價(jià)

吸取適量敵菌靈農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)貯備液，分別使用甲醇及空白樣品處理液進(jìn)行定容，得到相同濃度的工作液后上機(jī)測(cè)定。

2 結(jié)果與討論

2.1 樣品提取溶劑的選擇

提取結(jié)果顯示，乙酸乙酯、丙酮和乙腈3種試劑均能有效提取敵菌靈，回收率分別為95%，92%，97%(均大于80%)，能達(dá)到農(nóng)藥殘留分析的要求[13]。其中使用乙腈提取時(shí)，在提取液加入氯化鈉并振蕩離心后能夠與水相有效分離，而丙酮卻難以與基質(zhì)中的水分離，為下一步的凈化工作帶來困難。與此同時(shí)，乙腈相較于乙酸乙酯，在樣品中提取出的色素、脂肪、蛋白等雜質(zhì)少，有利于下一步的凈化。綜合考慮，選擇乙腈作為提取試劑。

2.2 凈化固相萃取柱的選擇

通過試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，GCB柱具有優(yōu)異的色素、雜質(zhì)吸附性能，但對(duì)被測(cè)物有較強(qiáng)的吸附，且難以洗脫，造成試驗(yàn)整體回收率偏低，其回收率在70%左右，而相對(duì)Florisil柱的回收率達(dá)到95%。故方法選擇色素吸附性能稍弱，但利于被測(cè)物洗脫，能夠滿足試驗(yàn)回收率要求的Florisil固相萃取柱作為凈化用固相萃取柱。

過GCB、Florisil固相萃取柱標(biāo)準(zhǔn)品圖譜見圖2、3。對(duì)比圖2～3可知，GCB固相萃取柱和Florisil固相萃取柱都能基本去除基質(zhì)中的干擾雜質(zhì)，但使用GCB柱凈化相對(duì)回收率較低，綜合被測(cè)物回收率及凈化效果，最終選擇Florisil固相萃取柱為凈化用固相萃取柱。

圖2 過GCB固相萃取柱標(biāo)準(zhǔn)品圖譜

Figure 2 MRM chromatogram of anilazine through GCB solid phase extraction column

圖3 過Florisil固相萃取柱標(biāo)準(zhǔn)品圖譜

Figure 3 MRM chromatogram of anilazine through florisil solid phase extraction column

2.3 固相萃取柱洗脫液的選擇

淋洗液與回收率圖譜見圖4。由圖4可知，洗脫液使用量為5 mL時(shí)，敵菌靈的回收率僅達(dá)到25%左右，并不能滿足農(nóng)殘分析要求；當(dāng)洗脫液用量提高到15 mL時(shí)，幾乎能完全將敵菌靈洗脫，回收率達(dá)到95%；增加使用量至20 mL時(shí)，未能顯著提高回收利率，故在綜合成本及效率因素考慮后，方法選擇使用15 mL正己烷—丙酮溶液(體積比85∶15)進(jìn)行洗脫。

圖4 淋洗液與回收率圖譜

2.4 基質(zhì)效應(yīng)的評(píng)價(jià)

經(jīng)過上機(jī)測(cè)定后發(fā)現(xiàn)，在番茄及黃瓜基質(zhì)中敵菌靈的離子化效率較甲醇溶液中低，基質(zhì)效應(yīng)在80%左右，結(jié)果見表3。故在樣品分析時(shí)采用相同基質(zhì)內(nèi)添加標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)曲線校正以消除基質(zhì)效應(yīng)的影響。

2.5 線性關(guān)系與檢出限

以濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)繪制敵菌靈標(biāo)準(zhǔn)工作曲線如圖3所示，在0.1～10.0 μg/mL的濃度范圍內(nèi)呈線性關(guān)系，線性方程為Y=172.63X-335.62 (R2=0.999 8)。

同時(shí)以3倍信噪比，測(cè)得敵菌靈方法檢出限為0.01 mg/kg；以10倍信噪比，測(cè)得敵菌靈方法定量限為0.03 mg/kg。

圖5 敵菌靈的標(biāo)準(zhǔn)工作曲線

2.6 準(zhǔn)確度及精密度試驗(yàn)

采用標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)添加法，選取番茄及黃瓜陰性樣品，分別添加0.03，0.10，0.50 mg/kg進(jìn)行回收率試驗(yàn)，每個(gè)添加水平重復(fù)測(cè)定6次，測(cè)定后得到敵菌靈在番茄及黃瓜基質(zhì)中的回收率及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)見表4。

3 結(jié)論

試驗(yàn)采用固相萃取前處理，建立了高效液相色譜—串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定番茄和黃瓜中敵菌靈殘留量的方法，并優(yōu)化了試驗(yàn)條件，在保證分離度的前提下，采用固相萃取小柱凈化，以C18色譜柱為分離柱，以甲酸水—乙腈為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫，經(jīng)LC-MS/MS檢測(cè)，以多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式監(jiān)測(cè)目標(biāo)化合物的特征離子進(jìn)行定性定量分析。該方法添加回收率在88.3%～95.2%，變異系數(shù)在4.5%～8.8%。試驗(yàn)證明高效液相色譜—串聯(lián)質(zhì)譜法前處理方法簡單、分離被測(cè)物能力強(qiáng)，能準(zhǔn)確定量、定性；能夠節(jié)省分析時(shí)間，提高檢測(cè)效率。使用試驗(yàn)方法完全可以滿足番茄和黃瓜中敵菌靈殘留量的日常檢測(cè)需求。但由于研究過程中，采用基質(zhì)種類與數(shù)量有限，在葉菜類等類似基質(zhì)樣品中的利用有待進(jìn)一步的探索和研究。

表4 敵菌靈回收率及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差測(cè)定結(jié)果