殼聚糖基納米氧化鋅—丁香精油抗菌復合膜對鮮肉保鮮效果

方丹丹 - 王利強,2 -,2

(1. 江南大學機械工程學院，江蘇 無錫 214122；2. 江蘇省食品先進制造裝備技術重點實驗室，江蘇 無錫 214122)

抗菌食品包裝是一種基于在食品包裝材料中加入抗菌物質以控制食物質量的不良變化的新型活性包裝形式。隨著人們安全意識和環保意識的增強，制備出可降解、綠色環保以及具備對細菌高度敏感的生物質材料已成為食品及包裝行業的研究熱點。

殼聚糖(chitosan)為甲殼素N-脫乙?；a物，是一種具有生物相容性、生物降解性和抗菌性的良好材料，對很多細菌具有抑制作用[1]。由于其機械和阻隔性能，限制了其在食品包裝中的應用，而與其他高分子材料復合是改善其性能的方法之一[2]。魔芋葡甘聚糖是由D-葡萄糖和D-甘露糖兩種多糖連接起來的大分子雜多糖，可直接溶解成為無色透明的溶液或是凝膠，用其制備的薄膜具有工藝簡單、價格低廉、可熱封的優點，具有很好的生物相容性及可降解性，可廣泛應用于食品保鮮[3]。殼聚糖和魔芋葡甘聚糖是兩種帶有相反電荷的聚電解質，可形成聚電解質復合物，利用兩種材料的互補性制備的復合材料具有更好的力學性能和阻隔性能[4]。

納米氧化鋅(1～100 nm)具有粒子尺寸小，比表面積大等特點。通過超聲分散作用，納米氧化鋅在基材中具有很強的納米分散能力，且與基材界面的相互作用很強[5]。根據美國食品和藥物管理局的協議(21CFR182.8991)，氧化鋅是公認的安全(GRAS)材料[6]。納米氧化鋅作為抗菌劑使用，對微生物具有很強的抑制作用，并與人體細胞保持良好的生物相容性[7]。這種無機抗菌劑能有效彌補殼聚糖膜性能的缺陷[2]，能強化其抗菌作用、機械性能。為了使復合膜的抑菌程度達到高度敏感或是極度敏感的程度，引入新的抗菌劑丁香精油。丁香精油為天然植物抗菌劑，在體外對不同的食源性病原體如大腸桿菌、空腸彎曲桿菌、腸炎沙門氏菌和單核細胞增生李斯特菌等顯示出優異的抗微生物活性[8]。

試驗擬以殼聚糖和魔芋葡甘聚糖為成膜基質，甘油為增塑劑，納米氧化鋅和丁香精油為抗菌劑，通過流延成膜法制備抗菌復合膜，并將復合膜用于鮮肉的保鮮試驗，以鮮肉色差、pH、菌落總數、揮發性鹽基氮為指標來評估復合膜的保鮮效果。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鮮豬肉：市售；

殼聚糖：脫乙酰度80%～95%，國藥集團化學藥劑有限公司；

魔芋葡甘聚糖：分析純，合肥博美生物科技有限公司；

甘油、丁香精油：分析純，國藥集團化學藥劑有限公司；

納米氧化鋅：粒度50 nm，分析純，阿拉丁試劑；

大腸桿菌菌種：CMCC(B)44102，上海魯微科技有限公司；

金黃色葡萄球菌菌種：CMCC(B)26003，上海魯微科技有限公司。

1.2 儀器與設備

數字顯示轉速電動攪拌機：JB200-S型，上海標本模型廠；

立式壓力蒸氣滅菌器：LDZM型，上海申安醫療器械廠；

垂直層流潔凈工作臺：HCB-1300V型，青島海爾特種電器有限公司；

色彩色差計：CR-400/410型，柯尼卡美能達。

1.3 試驗方法

1.3.1 抗菌復合膜的制備

(1) 殼聚糖膜液的制備：稱取一定量的殼聚糖粉末倒入體積分數1%乙酸溶液中，配制成質量分數1%殼聚糖溶液，60 ℃攪拌1 h充分溶解。

(2) 魔芋葡甘聚糖膜液的制備：稱取質量分數0.5%魔芋葡甘聚糖倒入60 ℃水中，攪拌5 min，60 ℃水浴2 h。

(3) 抗菌復合膜的制備：將魔芋葡甘聚糖膜液60 ℃水浴使其從凝膠狀變為溶液狀態，與殼聚糖膜液進行共混，加入質量分數25%甘油，制備成混合膜液。稱取6%(相對于殼聚糖和魔芋葡甘聚糖干重的質量分數)納米氧化鋅溶于去離子水中，使用超聲細胞分散機將其分散在水溶液中，再添加到混合膜液中。加入質量分數0.2%吐溫80攪拌1 h，再分別加入體積分數0.0%，0.2%，0.4%，0.6%，0.8%，1.0%丁香精油，定容至300 mL，再次攪拌1 h，10 000 r/min均質5 min，將配置好的溶液倒在干凈的有機玻璃板上，烘干。冷卻揭膜，保存備用。

1.3.2 抗菌性能的測定 根據GB/T 31402—2015對復合膜的抑菌性能進行表征。其中，覆蓋膜采用PE膜，空白膜為未加抗菌劑的薄膜，抗菌膜為添加質量分數6%納米氧化鋅和不同濃度丁香精油的復合抗菌膜。將覆蓋膜和試樣樣品放入無菌自封袋中，加入20 mL洗脫液，用手充分揉搓袋中試驗樣品和覆蓋薄膜，將細菌洗下，充分搖勻后，吸取1 mL菌液，稀釋成10-1，10-2，…，10-5，分別取0.1 mL接種于平板計數瓊脂培養基中，(37±1) ℃下培養24～48 h，按GB/T 4789.2—2016的方法測定菌落數，每個樣品平行3次。按式(1)計算抑菌率。

(1)

式中：

R——抑菌率，%；

B——PE膜每平皿平均回收菌落數，CFU；

C——抗菌膜每平皿平均回收菌落數，CFU。

1.3.3 紅外光譜分析 使用傅立葉變換紅外光譜儀對復合薄膜進行紅外光譜表征，掃描范圍4 000～500 cm-1。

1.3.4 微觀結構分析 采用掃描電鏡在不同放大倍數下觀察膜微觀結構，直至出現清晰圖片為止，抓取圖片并進行分析。

1.3.5 鮮肉保鮮試驗

(1) 肉樣處理：將抗菌膜、PE膜、案板和刀具使用95%酒精擦拭后，于超凈臺進行紫外滅菌(30 min)。將新鮮肉樣切割成10 g長方形，分別用PE膜(對照)空白膜、抗菌復合膜將其裹包，將3個肉樣放入同一托盤中，用保鮮膜封好。其中，空白膜(CL-0)為不添加抗菌劑薄膜，抗菌復合膜為添加質量分數6%納米氧化鋅和體積分數0.6% 丁香精油的復合膜(CL-6)。將包裝好的肉樣置于4 ℃ 冰箱中，分別在第0，2，4，6，8，10，12，14天測定樣品色差、pH、菌落總數、揮發性鹽基氮等指標。

(2) 色差測定：使用色差儀對肉樣L*值、a*值和b*值進行測定，每組樣品測試5次。

(3) pH測定：按照GB 9695.5—2008進行測定。

(4) 菌落總數測定：按照GB 4789.2—2010進行測定。

(5) 揮發性鹽基氮(TVB-N)測定：按照GB 5009.228—2016，采用微量擴散法進行測定。

1.4 數據處理

采用Origin 8對試驗數據進行處理。

2 結果與討論

2.1 復合膜的抑菌試驗

當抑菌率>90%時，復合膜具有抑菌作用；當抑菌率>99%時，復合膜具有強抑菌效果。由表1可知，添加納米氧化鋅和丁香精油后菌落數明顯減少，兩者結合后的抗菌效果更佳。菌落數隨丁香精油添加量的增加而減少，抗菌效果越明顯，對兩種細菌均具備較好的效果。空白膜為殼聚糖—魔芋葡甘聚糖復合膜，該復合膜對目標菌種抑菌率分別為82.68%，82.18%，抗菌作用力較弱。添加質量分數6%納米氧化鋅和體積分數0.2%丁香精油的復合膜，對目標菌種抑菌率為90.24%，91.23%；當丁香精油添加量為0.6%時，該復合膜對目標菌種抑菌率分別為99.78%，99.06%，具有強抗菌作用。這是因為丁香精油中含有丁香酚，其中酚反應性基團和殼聚糖的官能團以及納米氧化鋅與細菌細胞膜有相互作用，在抑制微生物的生長中起著至關重要的作用[9]，且納米氧化鋅和丁香精油在抗菌方面會產生協同作用。故丁香精油體積分數為0.6%～0.8%較為合適。

表1復合包裝膜對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的抑菌率

Table 1 Antibacterial rate of composite packaging film of different content of clove oil toStaphylococcusaureusandEscherichiacoli%

樣品金黃色葡萄球菌大腸桿菌PE膜0.000.00空白膜82.1882.680.2%丁香精油91.2390.240.4%丁香精油97.5896.110.6%丁香精油99.0699.780.8%丁香精油99.7399.821.0%丁香精油99.9999.98

2.2 紅外光譜分析

由圖1可知，3 387 cm-1處為殼聚糖與魔芋葡甘聚糖分子之間的氫鍵作用以及殼聚糖的氨基伸縮振動吸收重疊形成的峰；2 897，1 555 cm-1處分別對應于CH2振動和H2O彎曲模式，1 404，1 021 cm-1處代表CH2彎曲振動；681 cm-1處為氧化鋅拉伸模式形成的峰。當在基質中分別摻入體積分數0.2%，0.4%，0.6%，0.8%，1.0%丁香精油時，其中與O—H振動鍵合的N—H鍵向較低頻率移動，分別從3 387 cm-1到3 360，3 323，3 342，3 336，3 307 cm-1，一方面是由于殼聚糖中的氨基與氧化鋅之間發生反應，另一方面是殼聚糖官能團與丁香精油中存在的酚反應性基團發生了鍵合[9]。

圖1 復合膜紅外光譜圖

Figure 1 Infrared spectrum of different content of clove oil composite film

2.3 微觀結構分析

由圖2可知，摻入丁香精油和氧化鋅的薄膜中，表面結構粗糙度比空白膜的明顯。粗糙度的增加可能是由于氧化鋅以及整個膜基質中的丁香精油液滴的分布，與體積分數0.6%丁香精油結合的殼聚糖—魔芋葡甘聚糖薄膜顯示出油相和基材相之間的相分離。丁香精油在基材表面觀察到其形狀像空心腔，是由于納米復合膜中存在的丁香精油的疏水性導致的，高含量低密度的丁香精油可定位在薄膜的上表面，從而形成微囊結構。具有疏水性質的丁香精油保留并定位在基質內，能阻礙水分子通過薄膜轉移，表明丁香精油可防止水分吸附，有助于降低薄膜的水蒸氣透過率[10]。在與精油結合的殼聚糖—魔芋葡甘聚糖薄膜中觀察到納米氧化鋅的分散性增強的現象，其在機制中均勻分布，未出現團聚現象，有利于維持復合膜結構，可能是由于納米粒子可以有效地吸附在油與水之間的界面上。

圖2 6%納米氧化鋅復合膜的微觀結構

2.4 鮮肉保鮮試驗

2.4.1 色差 由表2可知，對照組在貯藏期間的L*值、a*值均低于CL-0、CL-6組的，b*值均顯著高于CL-0、CL-6組的。對照組L*值隨貯藏時間的增加而降低，甚至更加明顯，由于光的擴散減少，使肉表面過量的水蒸發導致顏色變暗。對照組a*值的顯著變化可能是由于脂質氧化和微生物腐敗作用。貯藏過程中乳酸菌產生的過氧化氫積累，導致肉制品顏色變化[11]。CL-6組樣品顯示出較低的顏色值變化，是因為添加納米氧化鋅和丁香精油的復合膜具有強的抗氧化和抗微生物性質。結果表明，將納米氧化鋅和植物精油摻入殼聚糖—魔芋葡甘聚糖膜中可以增強膜的抗氧化和抗菌性能，從而保持鮮肉樣品的質量。

表2 鮮肉色差隨貯藏時間的變化

2.4.2 pH 由圖3可知，鮮肉初始pH為5.81，主要是由糖原基被分解為乳酸造成的，與Hu等[12]報道的5.97相當接近；貯藏至第8天時，對照組pH逐漸增加至7，可能是由于需氧細菌的增殖所致；將CL-0、CL-6抗菌膜應用于豬肉表面時，可顯著降低pH的增加速度，尤其是CL-6膜對pH值的增加速度影響更為顯著。對照組第4天pH達6.56，為次鮮肉，CL-0組第8天pH為6.32，為次鮮肉；經CL-6復合膜處理過的樣品的pH在0～8 d略微增加，第12天pH為6.27(變為次鮮肉)，pH增加幅度變大。基于納米氧化鋅和丁香精油的膜的抗微生物效力可解釋包裹樣品的較低pH。

圖3 鮮肉pH值隨貯藏時間的變化

2.4.3 菌落總數 由圖4可知，鮮肉初始菌落總數為3.7 lg CFU/g，表明肉中存在微生物，可能是在切片制備或是包裝等過程中被污染。貯藏0～4 d，對照組(PE膜包裝)菌落總數急劇增加，且第4天時超過6 lg CFU/g(鮮肉的可接受上限)，已開始腐敗變質；CL-0組菌落總數略低于對照組，對細菌生長有一定抑制作用，貯藏至第4天時細菌總數為4.27 lg CFU/g，為次鮮肉；CL-6組貯藏至第6天時仍處于新鮮肉范圍內，第8～14天為次鮮肉(第14天時細菌總數為5.35 lg CFU/g)，較空白組延長保鮮6～8 d。因此，納米氧化鋅和丁香精油可顯著抑制食物腐敗微生物的生長，保持肉質質量。

圖4 鮮肉菌落總數隨貯藏時間的變化

Figure 4 The logarithm of the total number of colonies of the meat sample varies with storage time

2.4.4 揮發性鹽基氮(TVB-N) 由圖5可知，CL-6組TVB-N值在貯藏期間含量較低。貯藏過程中，所有樣品TVB-N值持續增加，但添加納米氧化鋅和丁香精油的復合膜的增長速率最小，歸因于細菌群體數量的快速減少或細菌對非蛋白質氮化合物的氧化脫氧能力的降低或兩者的氧化脫氨能力的降低[13]?？瞻捉M貯藏至第2天時TVB-N值為18.2 mg/100 g，為次鮮肉，第4天為22.4 mg/100 g，已腐敗變質。CL-0組貯藏至第4天時TVB-N值為16.6 mg/100 g，第8天為20.1 mg/100 g，已腐敗變質。CL-6組貯藏至第14天時TVB-N值為23.5 mg/100 g，較對照組和空白組，可延長保鮮6～8 d，表明CL-6膜中組分具有減少蛋白質分解及含氮物質釋放的作用。故添加納米氧化鋅和丁香精油的抗菌薄膜具有優異的耐腐性，可延長鮮肉保質期。

圖5 肉樣的揮發性鹽基氮含量隨貯藏時間的變化

Figure 5 Total number of TVB-N value of meat samples

3 結論

將納米氧化鋅和丁香精油作為抗菌劑，添加至殼聚糖—魔芋葡甘聚糖基膜中，通過流延法制備抗菌復合膜。當丁香精油濃度達0.6%(體積分數)時，制備的復合膜對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌具有很強的抗菌作用，表明丁香精油和納米氧化鋅在抗菌方面具有很好的協同作用。在鮮肉保鮮試驗中，綜合各指標發現，PE膜對鮮肉的保質期為4 d左右，無抗菌劑的空白復合膜保質期為6～8 d，添加質量分數6%納米氧化鋅和體積分數0.6%丁香精油的復合膜的鮮肉保質期超過14 d，該抗菌膜可提高鮮肉保質期6～8 d，可有效用于鮮肉保鮮。試驗以丁香精油為抗菌劑添加到復合膜中，達到了很好的抗菌效果，但丁香精油本身具有揮發性，需進行模擬試驗以確定其釋放規律。