北沙參多糖復合酶提取工藝及理化性質研究

景永帥 - 張丹參 - 張瑞娟 - 韓 鈺 劉東波 - 鄭玉光 - 吳蘭芳 -

(1. 河北科技大學化學與制藥工程學院，河北 石家莊 050018；2. 河北中醫學院藥學院，河北 石家莊 050200)

北沙參為傘形科植物珊瑚菜(GlehniaLittoralisFr. Schmidt ex Miq.)的干燥根，是傳統的名貴藥材和藥食同源物品，具有滋陰清肺、益胃生津等功效[1-2]。其有效成分主要為香豆素類、聚炔類及多糖類物質，其中多糖類含量最高，具有抗氧化和調節免疫等功能[3-4]。

北沙參多糖提取方法主要有熱水回流提取法[5]、微波輔助提取法[3]、超聲波輔助提取法[6]、酸堿提取法[7]、酶提取法[7]等。酶提取法因其提取條件溫和，可加速有效成分釋放、純化提取液中的提取物等特點，已被廣泛應用于植物中有效成分的提取[8-10]。常用的酶有纖維素酶、果膠酶、蛋白酶或復合酶。纖維素是細胞壁的主要成分，也是多糖溶出的主要屏障，利用纖維素酶水解細胞壁，可加速多糖的溶出，且對細胞內的物質結構無影響；木瓜蛋白酶是含巰基肽鏈的內切酶，具有蛋白酶和酯酶的活性，可水解蛋白質，幫助多糖溶出[11]。使用單一酶提取北沙參多糖已有研究[7]，而研究采用復合酶提取北沙參多糖較少[12]。

試驗擬選用纖維素酶和木瓜蛋白酶按一定比例進行北沙參多糖提取，應用響應面法確定最佳提取工藝，并對其結構特征進行分析，考察其對DPPH自由基的清除作用，為提高北沙參多糖的提取率及開發利用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

北沙參：產自河北保定，亳州市問善堂藥業科技有限公司；

1,1-二苯基-2-苦味基肼(DPPH)、1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(PMP)、甘露糖(Man)、鼠李糖(Rha)、葡萄糖醛酸(GlcA)、半乳糖醛酸(GalA)、葡萄糖(Glc)、半乳糖(Gal)、木糖(Xyl)、阿拉伯糖(Ara)、巖藻糖(Fuc)、DEAE-52纖維素：色譜純，上海阿拉丁試劑有限公司；

纖維素酶：1×105U/g，寧夏夏盛實業集團有限公司；

木瓜蛋白酶：1×105U/g，南寧龐博生物工程有限公司。

1.2 儀器與設備

恒溫水浴鍋：HH-2型，江蘇金壇宏華儀器廠；

磁力加熱攪拌器：DF-2型，江蘇金壇宏華儀器廠；

旋轉蒸發儀：EYELAN-1100型，日本東京理化株式會社；

超聲波清洗器：KS-300DE型，昆山潔力美超聲儀器有限公司；

傅里葉變換紅外光譜儀：S-100型，德國珀金埃爾默公司；

TSK-GEL凝膠柱：G4000 PWXL、G2500 PWXL型，日本東京株式會社；

液相色譜儀：LC1220型，安捷倫科技(中國)有限公司；

液相色譜儀：e2695型，美國Alliance公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 北沙參預處理 取北沙參粉碎，過40目篩，用3倍體積的95%乙醇回流提取2次，除去脂溶性成分，藥渣干燥后，備用。

1.3.2 北沙參多糖提取工藝優化

(1) 酶解時間：取5 g經預處理的北沙參粉末，酶解溫度70 ℃，液料比20∶1 (mL/g)，纖維素酶與木瓜蛋白酶質量比1∶1，酶添加量1%(質量分數)，考察酶解時間(1，2，3，4 h)對多糖提取率的影響。

(2) 酶解溫度：取5 g經預處理的北沙參粉末，液料比20∶1 (mL/g)，纖維素酶與木瓜蛋白酶質量比1∶1，酶添加量1%(質量分數)，酶解2 h，考察酶解溫度(40，50，60，70，80 ℃)對多糖提取率的影響。

(3) 液料比：取5 g經預處理的北沙參粉末，酶解溫度70 ℃，纖維素酶與木瓜蛋白酶質量比1∶1，酶添加量1%(質量分數)，酶解3 h，考察液料比[20∶1，30∶1，40∶1，50∶1 (mL/g)]對多糖提取率的影響。

(4) 酶添加量：取5 g經預處理的北沙參粉末，酶解溫度70 ℃，液料比30∶1 (mL/g)，纖維素酶與木瓜蛋白酶質量比3∶1，酶解3 h，考察酶添加量(1%，2%，3%，4%，質量分數)對多糖提取率的影響。

(5) 纖維素酶與木瓜蛋白酶質量比：取5 g經預處理的北沙參粉末，酶解溫度70 ℃，液料比30∶1 (mL/g)，酶添加量1%(質量分數)，酶解3 h，考察纖維素酶與木瓜蛋白酶質量比(1∶1，1∶2，2∶1，1∶3，3∶1)對多糖提取率的影響。

(6) 響應面試驗優化：根據Box-Behnken中心組合試驗設計原理，選取酶解時間、液料比和酶添加量為響應面因素，利用Design-Expert 8.0軟件設計優化提取工藝，并對結果進行分析。

1.3.3 多糖提取率的測定 按式(1)計算多糖提取率。

(1)

式中：

E——多糖提取率，%；

C1——粗多糖質量，g；

C2——樣品質量，g。

1.3.4 分離純化 采用DEAE-52纖維素柱層析法對北沙參粗多糖進行分離純化。取北沙參多糖(GLP-E)約200 mg，加入10 mL蒸餾水溶解，離心，上樣，分別以蒸餾水和0～1 mol/L NaCl洗脫，并用自動收集器收集，每10 min 收集一管，苯酚—硫酸法顯色。

1.3.5 理化性質分析

(1) 傅里葉變換紅外光譜(FT-IR)分析：檢測北沙參多糖在4 000～450 cm-1處的FT-IR[13]。

(2) 北沙參多糖相對分子質量：采用HPGPC-ELSD法[14]。以保留時間為橫坐標，相對分子質量為縱坐標，繪制標準葡聚糖標準曲線(y=-0.310 8x+11.749，R2=0.991 1)，根據標準曲線計算北沙參多糖相對分子質量。色譜柱為TSK-GEL G4000 PWXL、TSK-GEL G2500 PWXL；流動相為超純水；柱溫30 ℃；進樣量20 μL；漂移管溫度60 ℃；霧化溫度30 ℃；載氣為N2；載氣流量2.0 mL/min。

(3) HPLC分析：根據文獻[15]略作修改。Eclipse XDB-C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；檢測波長245 nm；柱溫30 ℃；上樣量20 μL；流速1 mL/min；流動相為磷酸鹽緩沖液(0.1 mol/L，pH 6.85)—乙腈(83∶17，體積比)；洗脫方式為等度洗脫。

1.3.6 清除DPPH自由基能力 參照文獻[16-17]。

1.4 數據處理

采用Design-Expert 8.0、Origin 8、SPSS 16.0和Excel等分析軟件對試驗數據進行處理分析。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗

2.1.1 酶解時間對北沙參多糖提取率的影響 由圖1可知，隨著酶解時間的增加，提取率總體呈先增后減趨勢，酶解3 h時提取率達峰值，可能是隨著酶解時間的增長，酶解作用充分發揮，使得提取率增大，但時間過長，部分多糖被酶解導致提取率降低。因此，選擇酶解3 h。

圖1 酶解時間對北沙參多糖提取率的影響

2.1.2 酶解溫度對北沙參多糖提取率的影響 由圖2可知，30～70 ℃時提取率隨酶解溫度的升高而上升；溫度繼續升高，提取率下降。隨著溫度的升高，多糖在溶劑中的溶解度、擴散系數增大，提取率增加；溫度過高，多糖結構受到破壞，且酶逐漸失活，提取率降低。因此，選擇酶解溫度為70 ℃。

2.1.3 液料比對北沙參多糖提取率的影響 由圖3可知，當液料比為30∶1 (mL/g)時，提取率最高，繼續增大液料比，提取率反而降低，其原因可能與液料比過高不利于多糖溶出有關。因此，選擇液料比為30∶1 (mL/g)。

圖2 酶解溫度對北沙參多糖提取率的影響

Figure 2 Effect of enzymolysis temperature on the extraction rate of polysaccharide fromGlehniaeRadix

圖3 液料比對北沙參多糖提取率的影響

Figure 3 Effect of liquid-to-solid ratio on extraction rate of polysaccharide fromGlehniaeRadix

2.1.4 酶添加量對北沙參多糖提取率的影響 由圖4可知，北沙參多糖提取率隨著酶添加量的增加先上升后下降，當酶添加量為3%時，提取率最高，可能是在一定范圍內，增加酶的用量有利于水解植物細胞組織，從而利于多糖的溶出；當酶添加量繼續增加時，北沙參多糖被過量的纖維素酶和木瓜蛋白酶降解，導致提取率降低。因此，選擇酶添加量為3%。

2.1.5 纖維素酶與木瓜蛋白酶質量比對多糖提取率的影響 由圖5可知，當纖維素酶與木瓜蛋白酶質量比為3∶1時，多糖提取率最高達21.9%；當纖維素酶與木瓜蛋白酶質量比為1∶3時，多糖提取率最低為12.7%，二者之間存在顯著差異。可能是酶種類不同，作用位點不同，纖維素酶可水解細胞壁，木瓜蛋白酶可水解蛋白質，有助于多糖溶出，當二者以適當比例復合時，才能顯著提高多糖提取率。因此，選擇纖維素酶與木瓜蛋白酶質量比為3∶1。

圖4 酶添加量對多糖提取率的影響

圖5 酶比對多糖提取率的影響

2.2 Box-Behnken試驗結果

采用Box-Behnken Design試驗設計方法，通過響應面分析尋求最優工藝參數[18]。根據單因素試驗結果，確定多糖酶解時間、液料比、酶添加量的各項參數水平(見表1)。采用Box-Behnken設計對北沙參多糖提取進行工藝優化，結果見表2。

由軟件分析所得各因素和響應值關系的二次多元回歸方程為：

Y=22.23+0.069A+0.17B-0.71C-0.34AB+0.93AC+0.40BC-1.36A2-2.26B2-2.12C2。

(2)

表1 Box-Behnken試驗設計因素水平表

表2 試驗設計及結果

表3 回歸模型方差分析?

2.3 等高線圖和響應曲面圖

由圖6～8可知，各等高線圖均呈橢圓形，說明酶解時間與液料比、酶解時間與酶添加量、液料比與酶添加量之間存在交互作用。

2.4 模型的驗證

通過Design-Expert 8.0軟件分析，北沙參多糖提取的最佳工藝條件為酶解時間2.98 h，液料比30.12∶1(mL/g)，酶添加量2.91%，為檢測該法的可靠性，考慮到實際操作的便利，最優工藝修正為酶解時間3 h，液料比30∶1 (mL/g)，酶添加量3%，進行3次驗證實驗，北沙參多糖提取率為(22.04±0.23)%，與預測值22.30%相差0.25%，說明用該模型對北沙參多糖的提取進行工藝優化具有一定的實際可操作性。該條件下的北沙參多糖提取率(22.04%)高于課題組前期研究[6]的(12.13%)，說明復合酶法提取多糖，有更好的協同作用，效率更高。

2.5 北沙參粗多糖分離純化

由圖9可知，蒸餾水和NaCl作為洗脫相，均有一個洗脫峰，分別命名為GLP-E1、GLP-E2。

2.6 GLP-E、GLP-E1、GLP-E2理化性質分析

圖6 酶解時間與液料比對多糖提取率的交互作用

圖7 酶解時間與酶添加量對多糖提取率的交互作用

圖8 液料比與酶添加量對多糖提取率的交互作用

圖9 北沙參粗多糖DEAE-52纖維素洗脫曲線圖

2.6.2 單糖組成 由圖11可知，GLP-E由GlcA、Glc、Gal和Ara組成；GLP-E1由GlcA、Glc、Gal和Ara組成；GLP-E2由Glc組成。

2.6.3 相對分子質量 由圖12可知，GLP-E具有3個吸

圖10 GLP-E、GLP-E1、GLP-E2紅外圖譜

1. Man 2. Rha 3. GlcA 4. GalA 5. Glc 6. Gal 7. Xyl8. Ara 9. Fuc

圖12 GLP-E、GLP-E1、GLP-E2相對分子質量分布圖

收峰，相對分子質量分別為4 662.98，376.89，10.40 kDa；GLP-E1具有2個吸收峰，相對分子質量分別為4 221.45，377.96 kDa；GLP-E2具有2個吸收峰，相對分子質量分別為4 626.41，10.24 kDa。由此可見，GLP-E、GLP-E1和GLP-E2為非均一多糖。

2.7 體外抗氧化活性

由圖13可知，在0～8 mg/mL濃度范圍內，GLP-E、GLP-E1、GLP-E2對DPPH自由基有一定的清除作用，且呈濃度依賴性。三者清除DPPH自由基的IC50值分別為1.918，7.422，3.392 mg/mL，清除能力大小為GLP-E>GLP-E2>GLP-E1，優于超聲波輔助提取法的(1.99 mg/mL)[7]和纖維素酶法的(6.317 mg/mL)[8]，但均低于陽性對照VC(IC50為0.005 mg/mL)的清除能力。

圖13 GLP-E、GLP-E1和GLP-E2對DPPH自由基的清除作用

李亞輝等[21]研究表明復合酶提取的多糖對DPPH自由基和羥基自由基的清除作用均略大于同質量濃度的VC。故復合酶法提取的多糖具有較好的抗氧化作用，可能由于：① 雙重酶解作用，有利于多糖的溶出；② 提取時間短、條件溫和，對多糖的結構破壞較?。虎?木瓜蛋白酶水解蛋白質，多糖溶出的同時，提高了多糖的純度[22]。

3 結論

通過單因素試驗及響應面綜合分析，得到復合酶法提取北沙參多糖的最優提取工藝為酶解溫度70 ℃，酶解時間3 h，液料比30∶1 (mL/g)，酶添加量3%，纖維素酶與木瓜蛋白酶質量比3∶1，此條件下的提取率為(22.04±0.23)%。經DEAE-52纖維素純化后得到兩個組分，GLP-E1 與GLP-E2。GLP-E由GlcA、Glc、Gal和Ara組成，相對分子質量分別為4 662.98，376.88，10.40 kDa；GLP-E1由GlcA、Glc、Gal和Ara組成，相對分子質量分別為4 221.45，377.96 kDa；GLP-E2由Glc組成，相對分子質量分別為4 626.41，10.24 kDa；且3種組分均表現出一定的清除DPPH自由基的能力，其IC50值分別為1.918，7.422，3.392 mg/mL。后期將對北沙參多糖的結構特征及體內抗氧化活性進行研究。