circ-PTBP3對血腫瘤屏障通透性的影響

馬珺，姚一龍，阮雪蕾，沈書園，邵連奇，薛一雪

（中國醫(yī)科大學(xué) 1.生命科學(xué)學(xué)院神經(jīng)生物學(xué)教研室，沈陽 110122；2.附屬盛京醫(yī)院神經(jīng)外科，沈陽 110004）

腦膠質(zhì)瘤是一種最常見的中樞神經(jīng)系統(tǒng)惡性腫瘤［1］，預(yù)后不良。主要原因是由于血腫瘤屏障（blood-tumor barrier，BTB）的存在嚴(yán)重限制了大分子化療藥物進(jìn)入腫瘤組織，影響治療效果［2］。因此，有效地增加BTB的通透性是切實(shí)提高腦膠質(zhì)瘤療效的關(guān)鍵。

人類基因組絕大部分轉(zhuǎn)錄為非編碼RNAs（non-coding RNAs，ncRNAs），ncRNAs對生命活動(dòng)具有重要的調(diào)控作用［3］。環(huán)狀RNAs（circular RNAs，circRNAs）是近年新發(fā)現(xiàn)的一類ncRNAs，存在于多種細(xì)胞，具有調(diào)控基因表達(dá)的作用［4］，與人類癌癥的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)［5］。研究［6］發(fā)現(xiàn)，在人腦膠質(zhì)瘤組織中存在大量異常表達(dá)的circRNAs，這些異常表達(dá)的circRNAs可能參與膠質(zhì)瘤的發(fā)生和發(fā)展。此外，缺氧可誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞中大量circRNAs表達(dá)水平的改變，提示circRNAs與血管功能密切相關(guān)。其中，circ-PTBP3（hsa_circ_0088072）在缺氧內(nèi)皮細(xì)胞中高表達(dá)［7］，但circ-PTBP3在BTB功能中的作用尚未見報(bào)道。因此，本研究擬探討circ-PTBP3對BTB功能的調(diào)控作用，以期為切實(shí)提高膠質(zhì)瘤的治療提供新靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞：人腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞（endothelial cells，ECs）系hCMEC/D3由Dr.Pierre-Olivier Couraud提供；人腦星形膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系U87和人正常星形膠質(zhì)細(xì)胞NHA購自中國科學(xué)院上海生命科學(xué)院細(xì)胞資源中心。

1.1.2 試劑：EBM-2（美國Lonza公司）；脂質(zhì)濃縮物（美國Gibco公司）；胎牛血清、HEPES（美國PAA公司）；皮質(zhì)醇（美國Sigma-Aldrich公司）；抗壞血酸（美國Sigma-Aldrich公 司）；bFGF（美 國Sigma-Aldrich公司）；Cultrex Rat CollagenⅠ（美國R&D公司）；Trizol（美國Thermo公司）；one-step PrimeScript RT-PCR Kit（日本Takara公司）；TaqMan Universal Master Mix Ⅱ（美國Thermo公 司）；TaqManGene Expression Assays（美國Thermo公司）；RNase-R（美國Sigma-Aldrich公司）；lipofectamine LTX和Plus試 劑（美 國Thermo公 司）；Lucifer yellow和FITC-Dextran（美 國Sigma-Aldrich公司）；兔抗ZO-1多克隆抗體（美國Thermo公司）；小鼠抗occludin單克隆抗體（美國Thermo公司）；小鼠抗claudin-5單克隆抗體（美國Thermo公司）；小鼠抗GAPDH單克隆抗體（美國Santa Cruz公司）；ECL試劑盒（美國Santa Cruz公司）；Alexa Fluor 555標(biāo)記的山羊抗小鼠和山羊抗兔熒光二抗（中國碧云天生物技術(shù)公司）。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)：hCMEC/D3細(xì)胞用含5%胎牛血清、1%青-鏈霉素、1.4 μmol/L皮質(zhì)醇、1%化學(xué)定義脂質(zhì)濃縮物、5 μg/mL抗壞血酸、10 mmol/L HEPES和1 ng/mL bFGF的EBM-2培養(yǎng)基培養(yǎng)于transwell小室上層（孔徑0.4 μm，150 μg/mL Cultrex Rat CollagenⅠ處理）。人腦膠質(zhì)母細(xì)胞瘤U87細(xì)胞培養(yǎng)于含有10%胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)液中。正常星形膠質(zhì)細(xì)胞NHA培養(yǎng)于含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液中。用于本研究的ECs hCMEC/D3細(xì)胞在30～40代之間。所有細(xì)胞均置于37 ℃、5%CO2的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.2 體外血腦屏障（blood-brain barrier，BBB）與BTB模型的建立：應(yīng)用正常星形膠質(zhì)細(xì)胞NHA和hCMEC/D3細(xì)胞共培養(yǎng)建立體外BBB模型，獲得ECs；應(yīng)用人腦膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞U87和hCMEC/D3細(xì)胞共培養(yǎng)建立體外BTB模型，獲得腦膠質(zhì)瘤微血管內(nèi)皮細(xì)胞（glioma endothelial cells，GECs）。方法如下，用transwell小室（孔徑0.4 μm）的下室，將U87或NHA細(xì)胞接種于6孔板中（2×104/孔），加入適量的培養(yǎng)液，培養(yǎng)48 h。然后，將hCMEC/D3細(xì)胞以2×105/孔的濃度接種于150 μg/mL Cultrex Rat CollagenⅠ處理的6孔transwell小室的上室，上下室均加入適量的EBM-2培養(yǎng)液，每2 d換液1次，共培養(yǎng)4 d［8］。

1.2.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）：Trizol法提取總RNA，用Nanodrop分光光度計(jì)測定RNA濃度及OD260/OD280比值。總RNA反轉(zhuǎn)錄后，應(yīng)用one-step PrimeScript RT-PCR Kit檢 測circ-PTBP3和PTBP3mRNA表達(dá)水平（RNase-R處理用于確認(rèn)circ-PTBP3的存在并排除線性RNAs的干擾）；應(yīng)用TaqMan Universal Master MixⅡ和 TaqMan Gene Expression Assays檢測緊密連接相關(guān)蛋白［ZO-1（Hs01551861_m1）、occludin（Hs00170162_m1）、claudin-5（Hs00533949_s1）和GAPDH（Hs03929097_g1）］的表達(dá)。應(yīng)用7500 Fast Real-Time PCR System測 定Ct值，以2-ΔΔCt表 示RNA的相對表達(dá)量。

1.2.4 細(xì)胞轉(zhuǎn)染：應(yīng)用靶向 circ-PTBP3的短發(fā)夾 RNA序列連接到pGPU6/GFP/Neo載體上，構(gòu)建circ-PTBP3表達(dá)沉默的質(zhì)粒（sh-circ-PTBP3）。攜帶非靶向序列的質(zhì)粒作為陰性對照（sh-NC）。以4×104/孔接種細(xì)胞于24孔板上，當(dāng)細(xì)胞融合度達(dá)80%時(shí)，采用lipofectamine LTX和Plus試劑進(jìn)行轉(zhuǎn)染。4周后，G418 抗性細(xì)胞克隆產(chǎn)生，用實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法驗(yàn)證沉默效率。

1.2.5 跨內(nèi)皮阻抗（transendothelial electric resistance，TEER）值的測量：建立體外BBB和BTB 模型，共培養(yǎng)第4天，將模型置于室溫30 min后，應(yīng)用millicell-ERS檢測系統(tǒng)進(jìn)行檢測。每個(gè)樣品的讀數(shù)減去背景電阻值（包括transwell的微孔膜和培養(yǎng)液），并與transwell小室的表面積相乘，獲得TEER值（Ω·cm2）。

1.2.6 通透性檢測：將transwell上下室培養(yǎng)液換為含有10 mmol/L HEPES和1 mmol/L丙酮酸鈉的緩沖液，在上室緩沖液中加入50 mmol/L Lucifer yellow（LY，457）、50 mmol/L fluorescein isothiocyanate（FITC）-Dextran（4×103）或20 mmol/L FITC-Dextran（70×103）。使用Florescence multiwall plate reader分析，應(yīng)用清除體積對時(shí)間作圖，其曲線斜率為通透性系數(shù)。

1.2.7 Western blotting檢測：用含有1%PMSF的預(yù)冷RIPA蛋白裂解液提取總蛋白。SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)移至PVDF膜，封閉2 h后，分別加入抗ZO-1抗體（1∶500稀釋）、抗occludin抗體（1∶250稀釋）、抗claudin-5抗體（1∶250稀釋）和抗GAPDH抗體（1∶1 000稀釋），4 ℃孵育過夜。用辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔或山羊抗小鼠IgG二抗孵育。ECL發(fā)光，用Microchemi儀器檢測，ChemImager 5500 V2.03軟件掃描，采用Fluorchem 2.0定量分析顯色帶的整合光密度值。

1.2.8 免疫熒光染色實(shí)驗(yàn)：用冷丙酮固定細(xì)胞，室溫封閉后，加入一抗4 ℃孵育過夜（1∶50稀釋）。洗脫后，用Alexa Fluor 555標(biāo)記的山羊抗小鼠或山羊抗兔熒光二抗（1∶500稀釋）室溫孵育2 h，洗脫后用0.5 μg/mL DAPI染核，甘油封片。應(yīng)用熒光顯微鏡進(jìn)行圖像采集與分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以±s表示，采用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。2組間比較采用Student’st檢驗(yàn)，3組及3組以上比較采用單因素方差分析和Dunnett’s posttest檢驗(yàn)，P＜ 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 circ-PTBP3在GECs中高表達(dá)

應(yīng)用人腦微血管ECs系hCMEC/D3與正常星形膠質(zhì)細(xì)胞系NHA建立體外BBB模型，獲得正常腦微血管ECs；應(yīng)用人腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞系hCMEC/D3與膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系U87建立體外BTB模型，獲得GECs。應(yīng)用qRT-PCR方法檢測circ-PTBP3在ECs和GECs中的表達(dá)，如圖1所示，circ-PTBP3在GECs中的表達(dá)水平顯著高于ECs（P＜ 0.01）。

2.2 RNase R處理后circ-PTBP3在GECs中高表達(dá)

圖1 circ-PTBP3在腦微血管內(nèi)皮細(xì)胞中的表達(dá)水平Fig.1 Expression of circ-PTBP3 in cultured brain endothelium

為明確線性RNA linear-PTBP3是否參與BTB功能的調(diào)控，檢測了PTBP3mRNA在ECs和GECs中的表達(dá)水平。如圖2A所示，PTBP3mRNA在ECs與GECs中的表達(dá)水平無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。RNase R可以降解線性RNA，卻不能降解circRNA。用RNase R處理后檢測circ-PTBP3在ECs和GECs中的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)circ-PTBP3在GECs或RNase R處理后的GECs中高表達(dá)，且能抵抗RNase R的降解，其表達(dá)水平在GECs與RNase R處理后的GECs中無顯著差異（圖2B）。

2.3 沉默circ-PTBP3破壞BTB的完整性并增加其通透性

應(yīng)用TEER值和通透性檢測法檢測circ-PTBP3表達(dá)沉默對BTB的完整性和通透性的影響。通過轉(zhuǎn)染sh-circ-PTBP3質(zhì)粒建立穩(wěn)定表達(dá)sh-circ-PTBP3的細(xì)胞系，circ-PTBP3的沉默效率如圖3A所示，sh-circ-PTBP3組的circ-PTBP3表達(dá)水平較sh-NC組顯著降低（P＜ 0.01）。sh-circ-PTBP3組 的TEER值 較sh-NC組顯著降低（P＜ 0.01）（圖3B）。進(jìn)一步檢測BTB對不同分子量物質(zhì)的通透性。如圖3C所示，sh-circ-PTBP3組對LY和4×103FITC-dextrans的通透性較sh-NC組均顯著增加（均P＜ 0.01），對70×103FITC-dextran的通透性與sh-NC組相比無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞ 0.05）。提示沉默circ-PTBP3可顯著破壞BTB的完整性并增加其通透性。

2.4 沉默circ-PTBP3降低GECs中緊密連接相關(guān)蛋白的表達(dá)

圖2 線性PTBP3 RNA的表達(dá)及RNase R處理后circ-PTBP3的表達(dá)情況Fig.2 Linear PTBP3 expression and circ-PTBP3 expression with RNase R treatment in cultured brain endothelium

圖3 circ-PTBP3可調(diào)節(jié)BTB的完整性和通透性Fig.3 circ-PTBP3 regulated the integrity and permeability of BTB

應(yīng)用Western blotting法檢測ZO-1、occludin和claudin-5的蛋白表達(dá)變化。結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染sh-circ-PTBP3組的ZO-1、occludin和claudin-5的蛋白表達(dá)水平較sh-NC組顯著降低（P＜ 0.05，P＜ 0.01，P＜ 0.05）（圖4A）。緊密連接相關(guān)蛋白的免疫熒光結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染sh-circ-PTBP3組 的ZO-1、occludin和claudin-5的 蛋白表達(dá)水平較sh-NC組顯著降低。并且ZO-1和occludin位于GECs邊緣，claudin-5位于細(xì)胞質(zhì)。免疫熒光染色結(jié)果顯示，sh-circ-PTBP3組ZO-1和occludin呈不連續(xù)性分布，claudin-5在細(xì)胞質(zhì)中呈低表達(dá)狀態(tài)（圖4B）。

3 討論

circRNAs普遍存在于真核細(xì)胞的基因組中，具有調(diào)控基因表達(dá)的作用。近年來發(fā)現(xiàn)circRNAs在腫瘤的發(fā)生和發(fā)展中發(fā)揮重要作用。越來越多的證據(jù)表明，circRNAs高度保守且穩(wěn)定表達(dá)于細(xì)胞質(zhì)［9］，它在膠質(zhì)瘤組織中存在大量的異常表達(dá)，可能在膠質(zhì)瘤的發(fā)生、發(fā)展等方面發(fā)揮調(diào)控作用，有望成為膠質(zhì)瘤診斷和治療的潛在靶標(biāo)［6］。

圖4 circ-PTBP3可調(diào)節(jié)GECs緊密連接相關(guān)蛋白的表達(dá)Fig.4 circ-PTBP3 regulated the expression of tight junction related proteins in GECs

近期有研究報(bào)道了circRNAs對膠質(zhì)瘤細(xì)胞的調(diào)節(jié)作用，發(fā)現(xiàn)circ-MMP9在膠質(zhì)瘤組織中高表達(dá)并可促進(jìn)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力［10］，circ-U2AF1可通過增加NOVA2的表達(dá)促進(jìn)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的惡性行為［11］，circ-NFIX通過調(diào)節(jié)Notch1與Notch信號通路促進(jìn)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的惡性行為［12］。此外，研究［7］發(fā)現(xiàn)缺氧可誘導(dǎo)ECs中大量circRNAs表達(dá)異常，提示circRNAs與血管功能密切相關(guān)。此外，還發(fā)現(xiàn)circ-SHKBP1在GECs中高表達(dá)，并可促進(jìn)膠質(zhì)瘤的血管新生［13］。以上提示circRNAs可能參與GECs功能的調(diào)控。研究［7］發(fā)現(xiàn)，circ-PTBP3（hsa_circ_0088072）在缺氧ECs中高表達(dá)。本研究結(jié)果證實(shí)，circ-PTBP3在GECs中高表達(dá)，提示，circ-PTBP3可能參與BTB微血管ECs功能的調(diào)控。

本研究證明，線性RNA linear-PTBP3在ECs和GECs中表達(dá)無差異。應(yīng)用 RNase R處理，降解了linear-PTBP3，未影響 circ-PTBP3的表達(dá)。因此推測，circ-PTBP3與linear-PTBP3是2個(gè)相互獨(dú)立的RNA，與circ-SHKBP1和circ-HIPK3相似［13-14］。有研究報(bào)道作為ncRNAs中的另一成員——lncRNAs可調(diào)控BTB屏障的通透性。沉默MIR17HG可降低緊密連接相關(guān)蛋白的表達(dá)，并增加BTB的通透性［15］；過表達(dá)MEG3通過負(fù)性調(diào)控miR-330-5p增加BTB的通透性［16］；沉默MALAT1可通過增加miR-140表達(dá)，增加BTB的通透性［17］。但目前尚未見circRNAs對BTB屏障通透性調(diào)控的報(bào)道。本研究沉默了circ-PTBP3，發(fā)現(xiàn)沉默circ-PTBP3可顯著降低BTB的TEER值，增加BTB的通透性。BTB主要由腫瘤細(xì)胞和腦微血管ECs構(gòu)成，相鄰的腦微血管ECs之間的緊密連接是維持屏障完整性的重要結(jié)構(gòu)和功能基礎(chǔ)［18］。本研究組前期報(bào)道了緊密連接相關(guān)蛋白ZO-1、occludin和claudin-5表達(dá)的下調(diào)，在通過細(xì)胞旁途徑增加BTB通透性的過程中起關(guān)鍵作用［8，17，19-20］。因此，本研究中檢測了緊密連接相關(guān)蛋白ZO-1、occludin和claudin-5的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)沉默circ-PTBP3可顯著減少ZO-1、occludin與claudin-5的表達(dá)與分布。以上研究結(jié)果提示，沉默circ-PTBP3可降低BTB的完整性并增加其通透性。

綜上所述，本研究證明了circ-PTBP3在GECs中高表達(dá)，沉默circ-PTBP3可破壞BTB的完整性并增加BTB的通透性，減少緊密連接相關(guān)蛋白的表達(dá)。此作用機(jī)制的闡明可為膠質(zhì)瘤的治療提供新的靶點(diǎn)。