自主設(shè)計試劑瓶插管改善血清CO2檢測質(zhì)量的研究

滿冬亮，程仕彤，康輝

（中國醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院檢驗(yàn)科，沈陽 110001）

高檢測速度的全自動分析儀在同時檢測多個項(xiàng)目的過程中，試劑倉高速重復(fù)旋轉(zhuǎn)和停止的動作可加速空氣進(jìn)入試劑瓶，對檢測結(jié)果有較大的影響。我科實(shí)驗(yàn)室目前使用的全自動分析儀配套試劑瓶由于缺乏隔絕空氣的裝置，導(dǎo)致分析儀連續(xù)工作一段時間后，其檢測的血清中二氧化碳（carbon dioxide，CO2）結(jié)果受到影響。針對上述問題，我科實(shí)驗(yàn)室自主改良設(shè)計了一種試劑瓶插管（實(shí)用新型專利：ZL 2016 2 0396761.8），本研究擬探討該裝置對全自動分析儀檢測血清CO2結(jié)果的改善情況。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑：瑞士羅氏公司配套CO2校準(zhǔn)品及檢測試劑盒，美國伯樂公司生化多項(xiàng)液態(tài)質(zhì)控品2水平、3水平（批號45680），生化多項(xiàng)液態(tài)質(zhì)控品2水平、3水平（批號45700）。

1.1.2 儀器：瑞士羅氏公司Cobas 8000全自動生化分析儀C701檢測模塊，臺灣衡欣公司CO2檢測儀AZ77535，自主設(shè)計試劑瓶插管。

1.1.3 樣品：收集40例我院門診及住院患者新鮮血清，無溶血、乳糜、黃疸，樣本量充足。其中，50%數(shù)量的樣本CO2濃度在參考區(qū)間之外，其余50%的樣本CO2濃度在參考區(qū)間之內(nèi)，且樣本CO2濃度盡量覆蓋整個CO2檢測試劑盒線性范圍。

1.2 方法

取2瓶新開瓶的羅氏配套CO2檢測試劑盒，其中1瓶試劑盒作為原廠瓶，另外1瓶插入試劑瓶插管的試劑盒作為改良瓶，將2瓶試劑同時加載在羅氏全自動生化分析儀同一檢測模塊同一試劑倉中的相鄰位置上，使用新開瓶CO2校準(zhǔn)品同時校準(zhǔn)原廠瓶和改良瓶試劑，此時生化分析儀剛開始運(yùn)行，記為運(yùn)轉(zhuǎn)0 h，在此時間用原廠瓶和改良瓶同時檢測日常工作用質(zhì)控品（美國伯樂批號45700的生化多項(xiàng)液態(tài)質(zhì)控品2水平、3水平）、2個水平的批內(nèi)精密度（美國伯樂批號45680的生化多項(xiàng)液態(tài)質(zhì)控品2水平、3水平）及雙份測定40例新鮮血清樣本。

運(yùn)轉(zhuǎn)0 h的樣本全部檢測完畢后，儀器正常進(jìn)行日常工作，在分析儀運(yùn)轉(zhuǎn)2 h時用原廠瓶和改良瓶同時檢測日常工作用質(zhì)控品，作為試劑狀態(tài)動態(tài)觀察，此時質(zhì)控數(shù)據(jù)記為運(yùn)轉(zhuǎn)2 h質(zhì)控數(shù)據(jù)。分析儀運(yùn)轉(zhuǎn)4 h時，再用原廠瓶和改良瓶同時檢測日常工作用質(zhì)控品、2個水平的批內(nèi)精密度及雙份測定40例新鮮血清樣本。

實(shí)驗(yàn)前對儀器進(jìn)行常規(guī)維護(hù)與保養(yǎng)，保證儀器處于日常工作狀態(tài)。實(shí)驗(yàn)中檢測試劑倉周圍空氣CO2濃度。

1.3 數(shù)據(jù)收集與處理及結(jié)果判斷

實(shí)驗(yàn)中檢測并記錄分析儀試劑倉周圍空氣CO2濃度值。直接收集質(zhì)控數(shù)據(jù)，并判斷是否在控。原廠瓶和改良瓶分別在0、4 h處連續(xù)檢測20次質(zhì)控樣本，估計批內(nèi)精密度并記錄（±s），判斷是否符合室內(nèi)要求。原廠瓶和改良瓶分別在0、4 h檢測的40例新鮮樣本數(shù)據(jù)呈正態(tài)分布，采用多元方差分析處理數(shù)據(jù)，記錄±s和P值，判斷結(jié)果是否有統(tǒng)計學(xué)意義。原廠瓶和改良瓶0、4 h檢測的40例新鮮樣本數(shù)據(jù)經(jīng)過離群值檢查合格，相關(guān)系數(shù)r≥0.975或r2≥0.95估計數(shù)據(jù)范圍合適，計算線性回歸方程（y=bx+a），在醫(yī)學(xué)決定水平判斷系統(tǒng)誤差（systemic error，SE），根據(jù)臨床要求，將給定的CO2醫(yī)學(xué)決定水平濃度xc代入回歸方程，計算各個回歸方程縱軸（y軸）與橫軸（x軸）之間的SE，判斷其是否被臨床接受。

結(jié)果判斷：（1）比較分析儀試劑倉周圍空氣CO2濃度與羅氏公司聲明的限值，小于為合格，否則為不合格。（2）質(zhì)控數(shù)據(jù)符合室內(nèi)質(zhì)控規(guī)則，則判斷為在控，否則為失控。（3）連續(xù)檢測的批內(nèi)精密度數(shù)據(jù)符合室內(nèi)精密度要求，變異系數(shù)（coefficient of variation，CV）＜1/4總誤差則判斷為符合，否則為不符合。（4）多元方差分析結(jié)果的判斷，P＜ 0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。（5）以室內(nèi)質(zhì)量要求的允許總誤差為判斷依據(jù)，比較評估的SE≤允許1/2總誤差則判斷測定結(jié)果具有可比性，比較結(jié)果臨床可以接受，否則為不可接受。

2 結(jié)果

2.1 分析儀試劑倉周圍空氣CO2濃度

分析儀試劑倉周圍空氣CO2濃度值約為850 ppm，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于正常空氣中400 ppm左右的CO2濃度，但符合羅氏聲明的需＜1 000 ppm的要求。

2.2 原廠瓶和改良瓶質(zhì)控數(shù)據(jù)

原廠瓶檢測的CO2室內(nèi)質(zhì)控品數(shù)值在儀器運(yùn)轉(zhuǎn)一段時間后即失控，改良瓶的檢測結(jié)果則始終在控。見表1。

2.3 原廠瓶和改良瓶批內(nèi)精密度

分別在分析儀運(yùn)行0 h及4 h檢測質(zhì)控品得到原廠瓶和改良瓶批內(nèi)精密度CV值，允許的1/4總誤差（1/4×20%）為5%。CV值均＜5%，符合實(shí)驗(yàn)室針對血清CO2批內(nèi)精密度的要求。各自的平均值、標(biāo)準(zhǔn)差、變異系數(shù)見表2。

2.4 多元方差分析

表1 室內(nèi)質(zhì)控數(shù)據(jù)及可接受范圍（mmol/L）Tab.1 The quality control data and acceptable range of quality control（mmol/L）

原廠瓶 0 h與改良瓶0 h ［（19.21±5.87）mmol/L vs（19.03±5.84）mmol/L，P=0.890］、原廠瓶0 h與改良瓶4 h ［（19.21±5.87）mmol/L vs（21.16±6.00）mmol/L，P=0.146］以及改良瓶0 h與改良瓶4 h［（19.03±5.84）mmol/L vs（21.16±6.00）mmol/L，P=0.111］檢測40例血清CO2濃度結(jié)果比較，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義；原廠瓶0 h與原廠瓶4 h ［（19.21±5.87）mmol/L vs（23.42±6.19）mmol/L，P=0.003］檢 測40例血清CO2濃度比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2.5 臨床可接受性判斷

分別對原廠瓶0 h與改良瓶0 h、原廠瓶0 h與改良瓶4 h、改良瓶0 h與改良瓶4 h以及原廠瓶0 h與原廠瓶4 h檢測患者血清CO2濃度比對結(jié)果進(jìn)行回歸分析，得到回歸方程、標(biāo)準(zhǔn)誤（Sy/x）、相關(guān)系數(shù)（r）。計算各個回歸方程醫(yī)學(xué)決定水平29 mmol/L處的SE，臨床檢測允許的SE＜1/2×總誤差（20%），即10%，則在醫(yī)學(xué)決定水平29 mmol/L處的SE界限即為2.9 mmol/L。計算的SE≤2.9 mmol/L，比較結(jié)果可接受，否則不可接受。不同試劑瓶及檢測時間的回歸方程及SE見表3。

表2 2個水平質(zhì)控品批內(nèi)精密度（n=20）Tab.2 The within-run precision of two level quality control materials（n=20）

表3 臨床可接受性判斷（n=40）Tab.3 Judgment of clinical acceptability（n=40）

3 討論

CO2在血液中主要以HCO3-形式存在，大約占血液運(yùn)輸形式的95%，其余為少量物理溶解的CO2及極少量的其他形式存在的CO2，目前可以用電極法或酶法檢測［1］。酶法是臨床生化檢驗(yàn)室檢測血清中CO2的主要方法，優(yōu)點(diǎn)是特異性強(qiáng)，能夠檢測出血清中所有形式的CO2，適用于全自動生化分析儀快速大批量的檢測，但缺點(diǎn)是試劑穩(wěn)定性不夠，校準(zhǔn)頻繁。

雖然酶法能夠檢測出血清中所有形式的CO2，但是并未見到檢測血清CO2結(jié)果偏高的報道，近年有報道依然是CO2試劑開瓶后不穩(wěn)定會導(dǎo)致其檢測結(jié)果偏低［2］。李廣權(quán)［3］認(rèn)為，應(yīng)用酶法檢測血清中CO2試劑不穩(wěn)定的主要原因有2點(diǎn)，一是檢測過程中試劑瓶口開放，易與空氣中的CO2發(fā)生反應(yīng)；其次是試劑反應(yīng)系統(tǒng)中的酶具有不穩(wěn)定性，如NADH容易被氧化分解，導(dǎo)致試劑空白值下降，檢測線性范圍變窄。陳潔等［4］嘗試在試劑中加入葡萄糖和葡萄糖脫氫酶，使NADH循環(huán)再生，從而提高試劑的穩(wěn)定性。而楊文杰等［5］通過在試劑液面上方加入石蠟油，隔絕空氣中CO2進(jìn)入試劑，以及在試劑中加入乳酸鋰及乳酸脫氫酶，使NADH再生這2種方式提高試劑的穩(wěn)定性。何敏等［6］研究發(fā)現(xiàn)，為了更好地解決由于非檢測原因?qū)е碌脑噭┲蠳ADH消耗分解而引起的血清中CO2檢測結(jié)果不穩(wěn)定，無論進(jìn)口試劑廠商還是國產(chǎn)試劑廠商都推出了改良型的濃縮酶法試劑盒，且檢測性能良好。綜上所述，應(yīng)用酶法檢測血清CO2結(jié)果不穩(wěn)定主要是由于試劑盒中NADH被消耗導(dǎo)致檢測線性范圍變窄，由于該反應(yīng)是檢測吸光度減小的下降反應(yīng)，故大量消耗NADH導(dǎo)致高值樣本檢測值偏低，但是自從各廠商推出了濃縮型的酶法試劑盒后，試劑盒中的NADH量充足，在廠商要求的有效期內(nèi)，很少發(fā)生儲存或存放在分析儀中的試劑盒由于空氣進(jìn)入或自身分解導(dǎo)致NADH大量減少，從而影響CO2檢測的情況。

發(fā)生在本實(shí)驗(yàn)室的情況與上述報道的情況不同，本實(shí)驗(yàn)室血清CO2的檢測試劑盒原理為磷酸烯醇丙酮酸羧化酶催化碳酸氫根與磷酸烯醇丙酮酸反應(yīng)，生成草酰乙酸和磷酸，草酰乙酸又在蘋果酸脫氫酶的作用下生成蘋果酸，導(dǎo)致NADH類似物的消耗，引起吸光度下降，該吸光度與被測樣本中碳酸氫根的濃度呈正比。筆者發(fā)現(xiàn)使用羅氏新型檢測模塊檢測血清CO2時，早上質(zhì)控良好，且樣本檢測也未發(fā)現(xiàn)異常，但是當(dāng)分析儀工作一段時間后就會出現(xiàn)CO2檢測值偏高的現(xiàn)象，CO2質(zhì)控值偏高，且樣本檢測值也都偏高。通過檢查檢測系統(tǒng)、質(zhì)控品及質(zhì)控范圍、系統(tǒng)中可能存在的污染及空間環(huán)境后，發(fā)現(xiàn)除空氣中CO2濃度偏高（達(dá)900 ppm左右），其他均未發(fā)現(xiàn)異常，故考慮可能是由于空氣中CO2濃度過高，且羅氏新型檢測模塊試劑倉高速運(yùn)轉(zhuǎn)加速了空氣中CO2進(jìn)入到試劑盒中參與了反應(yīng)，導(dǎo)致CO2檢測值普遍偏高，這種情況在之前的舊檢測系統(tǒng)未觀察到是由于其檢測速度不夠快，試劑倉運(yùn)轉(zhuǎn)速度不夠高，空氣中CO2進(jìn)入到試劑盒中較慢，故對結(jié)果影響較小。羅氏公司發(fā)出的通告也證實(shí)了這一點(diǎn)，通告中明確了分析儀試劑倉運(yùn)轉(zhuǎn)使空氣中過高濃度的CO2進(jìn)入到開放的試劑中，導(dǎo)致患者樣本檢測結(jié)果偏高，建議控制環(huán)境中CO2濃度在1 000 ppm以下，發(fā)現(xiàn)檢測結(jié)果偏高時應(yīng)立即執(zhí)行空白校準(zhǔn)及增加質(zhì)控頻率，更換試劑盒包裝規(guī)格。通過實(shí)際檢測發(fā)現(xiàn)，本實(shí)驗(yàn)室空氣中CO2濃度雖然確實(shí)高于正常空氣中CO2濃度，但都在1 000 ppm以下，符合試劑廠商要求。然而，實(shí)際操作中還是發(fā)現(xiàn)無論廠商給出的解決方案還是文獻(xiàn)報道的方法，均不能實(shí)施或不能徹底解決CO2檢測值偏高的問題，故本實(shí)驗(yàn)室自主設(shè)計了試劑瓶插管，擬通過延緩空氣中CO2進(jìn)入試劑瓶來達(dá)到改善CO2檢測質(zhì)量的目的，并進(jìn)行了相關(guān)研究。

本研究中檢測到分析儀試劑倉周圍空氣CO2濃度在850 ppm左右，未插入試劑瓶插管的原廠瓶在分析儀運(yùn)轉(zhuǎn)2 h后質(zhì)控即失控，而插入試劑瓶插管的改良瓶的質(zhì)控未發(fā)生失控，說明空氣中CO2濃度雖然符合廠商＜1 000 ppm的要求，但原廠瓶在高CO2濃度環(huán)境中檢測質(zhì)控品CO2會受到明顯影響，而改良瓶改善效果明顯。接下來通過估算批內(nèi)精密度調(diào)查造成檢測質(zhì)控品CO2偏高的誤差來源是否主要來自隨機(jī)誤差，結(jié)果顯示，分析儀運(yùn)轉(zhuǎn)0 h、4 h原廠瓶和改良瓶檢測質(zhì)控品得到的批內(nèi)精密度均遠(yuǎn)小于室內(nèi)精密度要求，說明檢測結(jié)果偏高的誤差來源并不主要來自隨機(jī)誤差；統(tǒng)計學(xué)分析及臨床可接受性判斷結(jié)果顯示，原廠瓶0 h與原廠瓶4 h檢測40例患者血清CO2差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P ＜ 0.05），比對結(jié)果誤差在臨床上不可接受，且誤差主要為系統(tǒng)誤差，而原廠瓶0 h與改良瓶0 h、原廠瓶0 h與改良瓶4 h以及改良瓶0 h與改良瓶4 h檢測40例患者血清CO2，差異均沒有統(tǒng)計學(xué)意義（P ＞ 0.05），比對結(jié)果SE在臨床上都可以接受，說明改良瓶在檢測樣本CO2方面雖也存在SE，但是改善檢測質(zhì)量效果明顯。

綜上所述，環(huán)境CO2濃度符合廠商要求的情況下，其新型分析儀檢測血清CO2結(jié)果偏高是由分析儀試劑倉高速運(yùn)轉(zhuǎn)使空氣中高濃度的CO2進(jìn)入到開放瓶口的試劑瓶中導(dǎo)致，本實(shí)驗(yàn)室自主設(shè)計的試劑瓶插管可以有效延緩空氣中的CO2進(jìn)入試劑瓶，減小因空氣中CO2參與反應(yīng)而產(chǎn)生的SE，從而改善檢測質(zhì)量，使血清CO2檢測結(jié)果更為準(zhǔn)確。