PDGFR/PI3K/Akt信號通路在PDGF-BB促進體外小鼠腦星形膠質細胞增殖中的作用

裴丹，李洪鵬

（1.錦州醫科大學基礎醫學院人體解剖學教研室，遼寧 錦州 121000；2.中國醫科大學基礎醫學院人體解剖學教研室，沈陽 110122）

神經系統的基本組織是神經組織，神經組織由神經元和神經膠質組成。神經膠質主要包括星形膠質細胞、施萬細胞、小膠質細胞和少突膠質細胞等。星形膠質細胞是中樞神經系統內數量最多的膠質細胞，在損傷、感染、缺氧、缺血或神經退行性疾病等病理條件下，星形膠質細胞可以發生活化反應，進而迅速增殖，最終形成膠質瘢痕。而且，損傷誘導的膠質細胞活化可直接或間接引起神經元死亡或修復。血小板衍生生長因子受體（platelet-derived growth factor receptor，PDGFR）與配體發生特異性結合后使受體二聚化暴露活性位點，從而激發酪氨酸激酶的活性，激活受體的自體磷酸化［1］和酪氨酸激酶活化。已有研究［2-3］指出，多種細胞包括巨噬細胞、成纖維細胞、周細胞、血管內皮細胞，都表達PDGFR。DEUEL等［4］也報道，巨噬細胞來源的PDGFR在炎癥和損傷修復時誘導單核細胞和成纖維細胞的趨化和增殖。據文獻［5］報道，在腎臟纖維化中磷脂酰肌醇-3-激酶（phosphoinositide 3-kinase，PI3K）的p85亞單位通過SH2結構域與磷酸化的PDGFR結合，再激活下游分子絲氨酸/蘇氨酸激酶（serine threonine protein kinase，Akt）如蛋白激酶B（protein kinase B，PKB）和蛋白激酶C（protein kinase C，PKC），后者使核蛋白體上絲氨酸殘基磷酸化，促進DNA的合成，促使肌動蛋白重組，介導代謝調節，刺激細胞生長并阻止細胞凋亡。

因此，本研究向體外培養的小鼠腦星形膠質細胞中加入血小板衍生生長因子BB（platelet-derived growth factor-BB，PDGF-BB），觀察對細胞的影響，并觀察給予PDGFR的小分子抑制劑AG1296后的變化，以驗證PDGFR/PI3K/Akt通路對星形膠質細胞活化的影響，為探究膠質細胞活化機制提供新的理論和實驗依據。

1 材料與方法

1.1 主要試劑和儀器

主要材料和試劑：新生昆明乳鼠（中國醫科大學實驗動物部），DMEM培養基（美國Invitrogen公司），胎牛血清（美國塔克拉公司），兔抗phosph-PDGFRα（英國Abcam），兔抗phosph-PI3K、兔抗phosph-Akt（Ser473）（美國Signalway Antibody），膠質纖維酸性蛋白（glia fibrillary acidic protein，GFAP）抗體（美國Millipore公司），FITC488熒光標記二抗（中杉金橋技術公司）。

主要儀器：恒溫CO2培養箱（Thermer371，美國Thermo公司），低溫高速離心機（CF16RXⅡ，日本HITACHI公司），熒光顯微鏡（Eclipse 80i，日本Nikon公司），電泳儀及轉膜儀、凝膠成像系統（美國Bio-Rad公司），電子分析天平（ER182，日本艾安德得公司），酶標板震蕩儀（RS-2，北京昊諾斯科技有限公司）。

1.2 細胞的培養、鑒定和分組

將新生1～3 d昆明小鼠的乳鼠，乙醇消毒，迅速斷頭取腦。顯微鏡下剝離腦膜后，取大腦皮質部分，剪碎，0.25%胰酶消化。終止消化后，4 ℃條件下1 000 r/min離心，加含有10% 胎牛血清的DMEM培養液將細胞濃度調至1×105/mL。接種于25 cm2培養瓶中，37 ℃、5% CO2條件下在細胞孵育箱中進行培養。2 d后換液，以后根據細胞生長狀態2～3 d換液。待細胞生長貼壁鋪滿瓶底80%左右時，胰酶消化進行傳代。

傳代至3代以后，0.25%胰酶消化，離心后取上清，加完全培養基調整細胞濃度為1×104/mL。接種于放置有無菌蓋玻片的6孔板中，每孔加入1.5 mL細胞懸液，置于37 ℃、5% CO2條件下進行培養。鏡下觀察細胞長滿瓶底80%左右時，進行免疫熒光染色。若免疫熒光染色GFAP陽性表達在90%以上，則表明星形膠質細胞純度較高，可以進行后續實驗。

實驗分為4組：對照組，共培養體系未加任何處理因素，換無血清 DMEM 培養液；PDGF-BB組，濃度10 ng/mL PDGF-BB作用細胞24 h；AG1296組，濃度10 μmol/L AG1296作用細胞24 h；PDGF-BB+AG1296組：濃度10 μmol/L AG1296作用細胞2 h后，加入濃度10 ng/mL的PDGF-BB。

1.3 免疫熒光染色

取培養細胞，棄掉培養基，PBS沖洗3次，加4%多聚甲醛固定液進行固定。10 min后吸除多聚甲醛，PBS清洗3次，加Triton透膜10 min，PBS清洗3次，0.5%牛血清白蛋白封閉30 min，加入兔抗GFAP的單克隆抗體（1∶500），4 ℃孵育過夜。第2天室溫孵育15 min，PBS清洗3次，加入新鮮配制的抗兔熒光二抗FITC（綠光），后續實驗都在避光條件下進行。37 ℃孵育90 min，PBS清洗3次，抗熒光淬滅劑封片，熒光顯微鏡鏡下觀察并拍照。

1.4 Western blotting

蛋白提取：用0.9%生理鹽水清洗細胞懸液，添加細胞體積4倍的含1% PMSF的RIPA裂解液之后，超聲粉碎機粉碎，4 ℃裂解30 min。采用紫外分光光度法測定蛋白濃度，取上清液，配置上樣體系，按照15 μL上樣，加入loading buffer并使其終濃度為1×，不足體積用PBS補齊，100 ℃、5 min蛋白變性后-80 ℃保存。配置分離膠和濃縮膠，移液器加樣，濃縮膠內電泳的電壓設為80 V，進入分離膠后轉換為120 V。按陰極-海綿墊-濾紙-膠-PVDF膜-濾紙-海綿墊-陽極的順序排列轉膜，用含5%血清的TBST溶液37 ℃封閉1 h，加入一抗稀釋液GAPDH（1∶10 000）、p-PDGFR-α（1∶200）、PDGFR-α（1∶200），p-PI3K（1∶500）、PI3K（1∶500），p-Akt（1∶500）、Akt（1∶500），GFAP（1∶3 000）4 ℃ 冰箱內搖床上孵育過夜，TBST 清洗10 min×3次，加入羊抗兔二抗（1∶5 000）室溫下孵育2 h，棄去二抗工作液，TBST漂洗10 min×3次，ECL發光用BIO-RAD凝膠電泳圖像分析儀進行采圖，應用圖像分析軟件（美國National Institutes of Health）對灰度值進行統計分析，檢測各指標的表達強度。

1.5 統計學分析

數據用±s表示，所有實驗重復進行3次。應用GraphPad Prism5軟件進行統計分析，多組間比較采用單因素方差分析，組間多重比較采用Bonferroni檢驗，P＜ 0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 免疫熒光染色鑒定星形膠質細胞

GFAP免疫熒光染色結果（圖1）顯示，傳代3次以上的星形膠質細胞GFAP陽性表達高于95%。因此，確認體外培養的腦皮質星形膠質細胞的純度可以進行后續實驗。

圖1 小鼠腦皮質星形膠質細胞GFAP免疫熒光染色結果Fig.1 Immunofluorescence staining of GFAP in mouse brain astrocytes

2.2 PDGF-BB誘導星形膠質細胞的活化表達

Western blotting結果（圖2）顯示，與對照組相比，PDGF-BB組GFAP蛋白表達明顯增高（P＜ 0.01）。免疫熒光GFAP染色結果（圖3）顯示，PDGF-BB可以誘導體外培養的腦皮質星形膠質細胞活化。與對照組相比，PDGF-BB組星形膠質細胞胞體肥大，突起變短變粗，GFAP陽性表達增強，說明PDGF-BB可以促進星形膠質細胞的活化表達。

2.3 PDGFR/PI3K/Akt信號通路參與PDGF-BB誘導的星形膠質細胞的增殖

圖2 PDGF-BB誘導后腦皮質星形膠質細胞中GFAP蛋白的表達Fig.2 The expression of GFAP in brain astrocytes after induction by PDGF-BB

圖3 PDGF-BB誘導腦皮質星形膠質細胞發生活化Fig.3 PDGF-BB induced the activation of astrocytes in the cerebral cortex

Western blotting檢測結果（圖4）顯示，與對照組比較，PDGF-BB組體外培養的腦皮質星形膠質細胞中p-PDGFRα、p-PI3K和p-Akt的表達均明顯增強（P＜ 0.01），而AG1296組細胞p-PDGFR、p-PI3K和p-Akt的表達沒有明顯變化；PDGF-BB+AG1296組應用抑制劑AG1296后再給予PDGF-BB刺激，星形膠質細胞p-PDGFRα、p-PI3K和p-Akt的表達分別被明顯抑制（P＜ 0.05）。說明PDGF-BB可以調控腦皮質星形膠質細胞中PDGFR和Akt信號通路的活化表達。

2.4 抑制PDGFR/PI3K/Akt信號通路活化可減弱PDGF-BB誘導的星形膠質細胞活化表達

采用Western blotting檢測星形膠質細胞中GFAP蛋白表達，應用抑制劑AG1296可減少星形膠質細胞中GFAP蛋白的表達，見圖5。對培養的星形膠質細胞進行免疫熒光GFAP染色檢測，結果發現，應用PDGFR信號通路抑制劑AG1296后，與對照組相比，PDGF-BB誘導的星形膠質細胞活化狀態均有所改善，具體表現為GFAP陽性表達減弱，胞體肥大減輕等。說明抑制PDGFR信號通路的活化可減弱PDGFBB誘導的星形膠質細胞活化。見圖6。

圖4 PDGF-BB和AG1296對PDGFR/PI3K/Akt信號通路活化表達的影響Fig.4 Effects of PDGF-BB and AG1296 on the expression of PDGFR/PI3K/Akt signaling pathway

3 討論

星形膠質細胞是腦中數量最多的非神經元細胞，也是神經系統內分布最廣泛的膠質細胞，能合成分泌多種神經遞質、激素及神經營養因子，具有維持神經元內外環境、免疫調節和信號轉導等功能［6］。外傷性或缺血性腦損傷后，星形膠質細胞發生活化，出現增殖、表型變化和細胞肥大，GFAP表達增加，成為反應性星形膠質細胞，并在阻礙神經損傷修復的過程中扮演了重要角色［7］，如增殖的膠質細胞會沿著損傷部位遷移，最終在損傷周圍形成膠質瘢痕；膠質細胞的過度活化，會產生大量黏附分子/細胞因子/生長因子受體，如白細胞介素-1β、腫瘤壞死因子-α和轉化生長因子-β1，促進炎癥反應，加劇神經元的損傷甚至導致其死亡。本研究結果顯示，給予PDGF-BB刺激后星形膠質細胞增殖增多細胞胞體肥大，突起變短變粗，說明體內損傷激活星形膠質細胞可以通過體外培養星形膠質細胞并用PDGF-BB刺激來模仿。

圖5 PDGF-BB和AG1296對星形膠質細胞GFAP表達的影響Fig.5 Effects of PDGF-BB and AG1296 on the expression of GFAP in astrocytes

圖6 AG1296和PDGF-BB對星形膠質細胞活化的影響Fig.6 Effects of AG1296 and PDGF-BB on the activation of astrocytes

本研究體外培養小鼠乳鼠的腦皮質星形膠質細胞，經純化鑒定后，應用PDGF-BB誘導其活化表達，模擬體內腦損傷后炎性細胞因子釋放導致的星形膠質細胞活化表達。PDGF-BB誘導后，星形膠質細胞發生活化，Western blotting結果顯示，p-Akt、p-PI3K以及p-PDGFRα蛋白在星形膠質細胞中的表達明顯增高，說明活化后的星形膠質細胞激活了PDGFR/PI3K/Akt信號通路；應用這條信號通路的抑制劑AG1296預處理星形膠質細胞后，再進行PDGFBB的誘導活化，免疫熒光染色和Western blotting結果發現，星形膠質細胞的活化表達情況如細胞形態、GFAP表達均有所改善。由此說明，PDGFR/PI3K/Akt信號通路參與PDGF-BB誘導的星形膠質細胞活化表達過程，抑制這條信號通路的活化可以有效改善星形膠質細胞的活化表達。

創傷性腦損傷后，星形膠質細胞發生活化［8-9］，炎性細胞因子如白細胞介素-1β、白細胞介素-6以及腫瘤壞死因子-α等表達增多［10-11］，膠質細胞的過度活化表達正反饋調節炎性細胞因子的表達，炎性細胞因子的過度釋放同樣正反饋調控膠質細胞的活化，這樣就在膠質細胞過度活化和炎性細胞因子過度釋放之間形成一個惡性循環，進一步加劇神經元的損傷，甚至導致其死亡，最終對神經功能產生嚴重影響。PI3K/Akt是PDGFR的下游分子，其信號轉導通路包括PI3K、Akt、PTEN及mTOR等分子，參與控制細胞的多種生物學行為，包括細胞的增殖、凋亡、自噬、轉錄、翻譯、細胞骨架重排及細胞周期調控等［12-16］。為進一步探究PDGFR 信號通路對腦損傷導致的星形膠質細胞活化的影響，本研究建立體外誘導星形膠質細胞活化模型，即PDGF-BB誘導小鼠乳鼠腦皮質星形膠質細胞的活化。應用PDGFR信號通路抑制劑AG1296抑制PDGFR、PI3K、Akt的活化，探究其對PDGF-BB誘導的星形膠質細胞活化表達的影響，即間接探究PDGFR信號通路對膠質細胞活化表達的影響。結果顯示，抑制PDGFR信號通路活化可以減弱PDGF-BB誘導的星形膠質細胞活化。本研究結果與以往研究結論一致。而作用的具體機制，仍需更精確縝密的實驗進行驗證。