血清循環microRNA在房顫患者中的表達

周玨珉 白雪

(西南醫科大學附屬中醫院心腦病科，四川 瀘州 646000)

房顫(AF)是致死和致殘的重要原因，故明確其發病機制顯得尤為重要。血漿或血清微小RNA(miRNA)是指血液循環中的胞外miRNA，能穩定存在且容易檢測，可作為潛在的生物學標志物。目前研究表明miRNA參與AF的發生發展，提示miRNA可作為AF生物學標志物及治療方面的潛在靶點〔1,2〕。其中miR-1及miR-21為目前在AF研究較多的小分子RNA，在AF的發病機制中發揮重要作用。然而，二者在AF、陣發性AF或持續性AF中的表達及聯合檢測價值的研究罕見報道。因此，本研究擬探討miR-1及miR-21在AF患者中的表達，分析二者與臨床指標間的相關性及其在AF中的聯合檢測價值。

1 資料和方法

1.1研究對象 收集2016年12月至2017年6月于西南醫科大學附屬中醫院心腦病科住院并確診為AF的患者60例，其中陣發性AF 30例，持續性AF 30例。健康對照組30例來自體檢中心，且心電圖未發現AF。排除標準：①年齡小于18歲或大于80歲；②器質性心臟病、充血性心力衰竭、冠心病、中至重度血管性疾?。虎蹏乐啬X血管疾?。虎苈宰枞苑渭膊。虎莞尾?、腎病病史；⑥甲狀腺功能異常；⑦使用抗心律失常藥物。研究對象均知情本項實驗研究，并自愿簽署知情同意書?；颊呷朐汉蟛杉韵滦畔ⅲ耗挲g、性別、既往病史、藥物治療等情況，常規進行實驗室等指標的檢測，主要包括總膽固醇(TC)、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、丙氨酸轉氨酶(ALT)、天冬氨酸轉氨酶(AST)、肌酐(Cr)、促甲狀腺激素(TSH)、游離甲狀腺激素(FT4)、游離三碘甲狀腺原氨酸(FT3)、前端B型腦鈉肽(proBNP)、肌鈣蛋白(cTnI)和肌酸激酶同工酶(CK-MB)等指標?；颊呔谖髂厢t科大學附屬中醫院超聲科行心臟彩超檢查，檢查均由專業超聲科醫師完成，記錄左房內徑(LAD)、左室收縮末期內徑(LVDs)、左室舒張末期內徑(LVDd)及左心室后壁(LVPW)等。

1.2血清miRNA提取，逆轉錄及實時熒光定量PCR 患者入院后抽取空腹靜脈血，離心后取血清于干燥管中，儲存于-80℃冰箱中保存。血清總miRNA提取使用天根生化科技(北京)有限公司的 miRcute血清/血漿miRNA提取分離試劑盒，依照說明書步驟進行實驗。釆用日本Takara公司的PrimeScript逆轉錄試劑盒進行逆轉錄反應。使用日本Takara公司的SYBR Premix Ex Taq試劑盒配好體系，在美國ABI公司的實時熒光定量PCR儀自帶軟件上檢測Ct值。Ct值超過40定義為未檢測到。miR-16用于參照基因，待測樣品的miRNA的相對表達量= 2-〔Ct(miRNA)-Ct(miR-16)〕。本研究中所用引物均來自參考文獻〔3〕。

1.3統計學分析 采用SPSS18.0軟件進行統計分析。兩組間樣本均數比較采用t檢驗或非參數檢驗，計數資料采用χ2檢驗或 Fishers 確切概率法。關聯性采用兩變量關聯性分析。本研究中因miRNA相對表達量不符合正態分布，經對數(log2)變換轉變為近似正態分布資料。使用受試者工作特征(ROC)曲線評估miRNA作為血清學指標區分疾病的能力。

2 結 果

2.1一般資料分析 與對照組比較，AF組既往病史(高血壓、糖尿病)、藥物治療、proBNP、CK-MB、LAD、LVDs、LVDd顯著升高(P<0.05)。與陣發性AF比較，持續性AF高血壓患者比例較大，proBNP水平亦顯著升高(P<0.001)。見表1。

表1 對照組與AF組的一般資料分析

P1值：對照組與陣發性AF組比較；P2值：對照組與持續性AF組比較；P3值：陣發性AF組與持續性AF組比較。體重指數(BMI)、左心室射血分數(LVEF)、血管緊張素轉化酶抑制劑(ACEI)、血管緊張素Ⅱ受體拮抗劑(ARB)

2.2miR-1、miR-21在對照組、陣發性AF組及持續性AF組中的表達 對照組、陣發性AF及持續性AF組血清Log2miR-1的相對表達水平呈遞減趨勢，差異有統計學意義(-6.631、-7.770、-8.601，P<0.001)。與對照組(-7.115)相比，陣發性AF及持續性AF組血清Log2miR-21的相對表達水平顯著降低(-8.676、-8.761，P<0.001)；持續性AF組與陣發性AF組比較無顯著差異(P=0.801)。

2.3miR-1、miR-21的表達與臨床指標間的相關性 Log2miR-1與Log2miR-21呈顯著正相關(P<0.001)，與LAD、LVDs呈顯著負相關(P<0.05,P<0.01)。Log2miR-21與LAD呈負相關(P<0.05)。Log2miR-1及Log2miR-21與proBNP、LVDd等指標有負相關傾向，但差異無統計學意義(P>0.05)。見表2。

2.4miR-1、miR-21及二者聯合檢測AF的ROC曲線 聯合檢測因子使用二元Logistic回歸分析獲得，公式為miR-1+miR-21×0.443/0.803。結果顯示miR-1、miR-21及聯合檢測因子miR-1×miR-21在區分AF患者方面均有良好的敏感性和特異性〔miR-1：ROC曲線下面積(AUC)=0.812,P<0.001,95%CI=0.710～0.913;miR-21：AUC=0.777，P<0.001,95%CI=0.669～0.885；miR-1×miR-21：AUC=0.826，P<0.001,95%CI=0.732～0.920〕。見圖1。

表2 miR-1、miR-21的表達與臨床指標間的相關性

圖1 miR-1、miR-21及聯合檢測因子miR-1×miR-21檢測AF的ROC曲線

2.5miR-1、miR-21及二者聯合檢測持續性AF的ROC曲線 聯合檢測因子使用二元Logistic回歸分析獲得，公式為miR-1-miR-21×0.886/1.766。結果顯示miR-1及聯合檢測因子miR-1×miR-21在區分陣發性AF及持續性AF患者方面均有良好的敏感性和特異性(miR-1：AUC=0.748，P=0.001,95%CI=0.621～0.874； miR-1×miR-21：AUC=0.782，P<0.001,95%CI=0.668～0.896)。而miR-21 AUC無統計學意義(AUC=0.529，P=0.695,95%CI=0.375～0.684)。見圖2。

圖2 miR-1、miR-21、聯合檢測因子miR-1×miR-21檢測持續性AF的ROC曲線

3 討 論

目前越來越多的研究證實miRNA參與AF的發生和發展，例如miR-1、miR-21、miR-26a、miR-29b、miR-30c、miR-133、miR-328以及 miR-499在心肌細胞中大量表達，參與調節心臟生理、興奮性及心律失常等方面〔4～11〕。血清/血漿循環miR-150、miR-409-3p、miR-432及miR-21可作為AF的潛在生物學指標〔12,13〕。本研究結果提示miR-1及miR-21可能為AF或持續性AF的潛在血清學指標。

miR-21在主要的心血管細胞類型都有表達〔14,15〕，廣泛參與心肌細胞肥大、凋亡壞死、成纖維細胞增殖及內皮細胞轉化，而這些恰恰是心臟結構重構的主要部分，也是AF誘發和維持的機制。目前研究認為miR-21在心臟結構重構不同的疾病模型及進展表達不一致，且發揮不同的作用。比較多的觀點是認為miR-21在成纖維細胞參與的心臟結構重構，如AF患者的心房組織中是上調的〔5,16〕。然而，血清/血漿循環miR-21 的表達卻與組織中的表達不同。國外研究發現，與對照組相比，血漿miR-21表達顯著下調，與心房組織中的miR-21表達水平成負相關，并且與陣發性AF比較，持續性AF患者的血漿miR-21表達水平亦顯著降低〔8,12,17〕。尚有研究發現，與對照組比較，血漿miR-21表達在持續性AF中顯著上調，而在陣發性AF中無明顯差異〔18〕。以上結果似有差異，推斷這種差異可能與納入患者的背景，如入選和排除標準、并發癥、治療等情況不同有關，而這需要未來更多的研究加以證實。此外，本研究還發現血清miR-21表達與LAD負相關，也從側面證實miR-21參與了心臟的重構。心肌細胞的miR-1在不同的心臟疾病中表達顯著下調，與心臟電傳導及心律失常的發生密切相關〔19,20〕。既往研究顯示，miR-1的過表達可以抑制超極化激活環核苷酸門控陽離子通道亞單位2/4(HCN2/HCN4)的表達，并且上調K+通道——KCNJ2及 GJA1(編碼連接蛋白43，心肌縫隙連接通道的主要蛋白)的表達，進而降低心房傳導速度以及復極化，阻止心律失常的發生〔21,22〕。還有研究發現，在肥大的心肌細胞miR-1表達下降，并且用miR-1轉染心肌細胞后，CANCNB2表達下降，提示miR-1通過抑制L型Ca2+通道——CANCNB2表達阻止心房重構〔23〕。本研究提示左心的結構和功能指標與miR-1表達水平的一種負性變化。這也從側面反映了miR-1與心房重構的關系，miR-1水平越低，可能提示心臟功能及心房結構情況改變更加嚴重。

本研究結果推斷循環miR-1及miR-21可用于聯合檢測AF。相關文獻顯示，在高血壓的大鼠模型中，主動脈組織的miR-1表達水平下調〔24〕。而proBNP是反映心功能障礙最為準確的血清學指標。因此，鑒于陣發性AF和持續性AF在分類和定義方面的相似性，未來需要更準確的實驗證實miR-1在區分兩種疾病中的作用。