樹突細胞-細胞因子誘導的殺傷細胞在抗腫瘤生長免疫治療中的應用

趙芳 張睿 王娟 王建華 許衛星 劉靜 尹風雷 蔡秀萍 馬洪玉 楊博

(1滄州市中心醫院血液一科，河北 滄州 061000；2滄州市中心醫院胸外科)

治療惡性腫瘤的經典方式為放療、化療、外科手術，但各自存在局限性，損壞機體免疫功能。細胞免疫治療方式在臨床研究與實際應用的案例逐漸增多，作為治療惡性腫瘤的第四種方法受到腫瘤研究領域關注〔1〕。郭衛東〔2〕探析樹突細胞(DC)-細胞因子誘導殺傷細胞(CIK)聯合化療治療晚期非小細胞肺癌的臨床效果，選擇某醫院兩年間治療的90例晚期非小細胞肺癌患者分為兩組，觀察6個周期，采用DC-CIK聯合化療治療，統計治愈率與生存率。Van Acker等〔3〕總結普通γ鏈家族細胞因子在γδT細胞抗癌免疫治療中的作用。常見γ鏈受體家族的細胞因子包括白細胞介素(IL)-2、IL-4、IL-7、IL-9、IL-15和IL-21，對于組織和維持健康免疫細胞功能至關重要。20世紀末期已經開始細胞免疫治療的研究，研究對象包括淋巴因子激活的殺傷細胞、腫瘤浸潤淋巴細胞、CD3單體克隆抗體激活的殺傷細胞等〔4〕，研究顯示上述細胞均存在一定的殺瘤活性，因為細胞增殖能力弱導致殺瘤效果不顯著。DC與CIK聯合作用即細胞免疫治療方法，DC-CIK聯合作用在免疫治療惡性腫瘤方面取得顯著成績〔5〕。其應用領域廣泛、治療安全性強、毒副作用少是DC-CIK的顯著優勢，具有明顯優化機體免疫力，可增強抗瘤活性的功能，利于提升腫瘤患者生命，臨床研究前景廣闊〔6〕。本文分析惡性腫瘤患者進行DC-CIK治療在抗腫瘤生長免疫治療中效果。

1 材料與方法

1.1收集病例 選取滄州市中心醫院腫瘤診療中心的臨床病例26例，病理學顯示均為惡性腫瘤患者，全部接受手術與化療治療方式。其中，乳腺癌5例、肺癌4例、腎癌3例、肝癌5例、乳腺癌轉肝癌2例、肝癌轉骨癌5例、乳腺癌轉肺癌2例。隨機分為觀察組與對照組，各13例。患者及其家屬簽署免疫治療同意書，自愿參與腫瘤治療研究。上述患者排除顱內轉移、重度心臟功能不健全情況，不存在重度精神病、并發性惡性腫瘤患者。兩組性別、年齡、美國東部腫瘤協作組(ECOG)評分、表皮生長因子受體(EGFR)狀態、TNM分期不存在統計學差異(P>0.05)，見表1。

1.2儀器與材料 儀器設備為(1)低速與高速離心機分別購自北京離心機廠、德國SIGMA公司；(2)細胞計數儀購自美國Invitrogen公司；(3)孵育箱型號為MCO-15AC，由日本三洋公司提供。試劑為(1)BTN無血清培養基由北京某生物有限公司提供；(2)CD3單抗與γ-干擾素(IFN)-γ由武漢生物研究所、上海克隆生物制品研究所提供；(3)淋巴細胞分離液購自北京某生物有限公司；(4)IL-2由上海某生物技術有限公司提供；(5)人血白蛋白來自上海萊氏血液公司。

1.3DC與CIK鑒定 采集惡性腫瘤患者的外周血單個核細胞進行檢測，利用粒細胞集落刺激因子(GM-CSF)、IL-4、腫瘤壞死因子(TNF)-α細胞因子誘導貼壁細胞，通過流式細胞儀檢測證明為DC；利用CD3單抗、IFN-γ、IL-2細胞因子誘導懸浮細胞，通過流式細胞儀檢測證明為CIK。

表1 兩組一般資料〔n(%)〕

1.4細胞培養 ①DC培養：進行外周血采集，采集前準備如下：使用50 ml注射器抽取0.5 ml肝素抗凝劑、抽取生理鹽水10 ml，反復多次抽吸注射器；采集患者自身外周血各65 ml后，采用血細胞分離機、淋巴細胞分離液分離提取單個核細胞，數量在2.9×109個左右，淋巴細胞分離液使用量為1.066 g/ml。單個核細胞經RPMI1640洗滌(洗滌次數為2次，轉速為1 560 r/min，時長為16 min)完成置入BTN無血清培養基混懸液在細胞培養瓶內，存儲在孵育箱中，設置溫度為36.8℃、二氧化碳含量為4.8%。計時2 h，移除懸浮細胞后置入IL-4和GM-CSF溶液各510 U/ml、1 100 U/ml，相同環境下培養。培養期間，6 d加入一次TNF-α約510 U/ml；22～3 w換液一次，IL-4和GM-CSF溶液換液量同上；換液完成與細胞回輸前實施細菌與真菌培養檢測。②CIK培養:將以上懸浮細胞作為基礎，使用無血清培養基至2×106U/ml，此時計時為第0天，同時置入CD3單抗與IFN-γ分別為1 μg/ml、2 000 μg/ml,孵育箱培養溫度與二氧化碳含量分別為36.8℃、4.8%，培養時長為24 h。第一天置入IL-2溶液1 100 μg/ml相同環境培養。2～3 w換液一次，IL-4和GM-CSF溶液換液量為510 U/ml、1 100 U/ml；每次換液完成與細胞回輸前實施細菌與真菌培養檢測。③DC-CIK共培養：微力磕打DC培養瓶，令細胞處于貼壁懸浮狀態；傾倒DC至CIK培養瓶中進行混合培養，孵育箱溫度為36.8℃、二氧化碳含量為4.8%。用以檢測DC-CIK共培養生成IFN-γ、IL-12、TNF-α細胞因子的能力。

1.5細胞回輸 DC回輸：細菌霉菌檢測在DC培養8、10、12、14 d后進行，檢測結果為陰性，且活細胞比重在95.5%以上。使用細胞刷提取細胞，并轉移到55 ml的離心管中，以15 min、1 500 r/min設定進行離心操作。除去上清液后，在含有20 g/L人血白蛋白的生理鹽水中進行洗滌，重復兩次；隨之將細胞懸浮存放在6.5～8.5 ml生理鹽水中，生理鹽水人血白蛋白含量為22 g/L。細胞回輸以每次3×108～8×108U的量進行，注射位置為兩側頸部、腋下及腹股溝淋巴引流區，行皮下注射。CIK回輸：細菌霉菌檢測在CIK培養12、14、16 d進行，檢測結果為陰性，且活細胞比重在95.5%以上。將細胞轉移到55 ml的離心管中，除去上清液后，在含有20 g/L人血白蛋白的生理鹽水中洗滌，重復兩次；隨后將細胞懸浮存放在260 ml生理鹽水中，生理鹽水人血白蛋白含量為22 g/L、IL-2含量為2×105IU，(1～3)×109為每次回輸細胞數量，使用輸血器以靜脈方式進行輸注。CIK回輸注意事項：(1)予患者10%葡萄糖酸鈣與苯海拉明，防止出現過敏現象；(2)觀察患者回輸過程中是否出現寒戰、發熱、過敏現象，心肺功能是否產生變化，并正確記錄。細胞培養與回輸期間患者進行40 d療程肌注，每隔一日進行一次分別進行IL-2 200萬U肌注、α-2b干擾素300萬U肌注。觀察組行DC與CIK回輸治療，對照組行CIK回輸治療。

1.6免疫治療評估 (1)免疫療效評估：總T細胞(CD3+)、輔助性T細胞(CD3+CD4+)、殺傷性T細胞(CD3+CD8+)、NK(CD3-CD56+)及CIK(CD3+CD56+)。免疫評估指標分兩次檢測，一是療程前，二是4個周期治療后。(2)腫瘤治療效果評估：①有所進展：患者自身癥狀減少20%以下，且癥狀始終呈現逐漸減少趨勢；②穩定：患者自身癥狀減少20%～30%，且呈減少趨勢；③部分緩解：患者自身癥狀減少30%以上，且該情況保持4 w；④完全緩解：癥狀全部消失，保持4 w以上。

1.7指標觀察與檢測 (1)細胞免疫表型檢測：采用流式細胞儀檢測培養8 w后的DC-CIK、CIK，記錄檢測結果。(2)細胞因子分析：IFN-γ、IL-12、TNF-α水平檢測方法為酶聯免疫吸附試驗(ELISA)雙抗體夾心法。(3)記錄治療過程中不良反應：包括發熱、發量減少、白細胞數量降低、血小板數量降低、惡心嘔吐及肝功能受損。

1.8統計學處理 采用SPSS19.0統計軟件進行t檢驗、χ2檢驗。

2 結 果

2.1不良反應率 觀察組與對照組發量減少、發熱占比存在統計學意義(P<0.05)；在白細胞數量降低、血小板數量降低、惡心嘔吐、肝功能受損方面，觀察組占比均低于對照組，但無統計學意義(P>0.05)。見表2。

2.2細胞免疫表型 兩組CD3+、CD3+/CD4+、CD3+/CD8+、CD3+/CD56+陽性細胞比例有顯著差異(P<0.05)。見表3。

表2 觀察組與對照組不良反應率〔n(%)，n=13〕

表3 兩組細胞免疫表型

與對照組相比:1)P<0.05

2.3細胞上清液中分泌的細胞因子分析 對培養7 w后的CIK與DC-CIK上清液中分泌的細胞進行因子檢測。CIK的IFN-γ、IL-12、TNF-α細胞因子表達均顯著低于DC-CIK(P<0.05)。見表4。

2.4腫瘤治療效果 兩組治療有效率存在顯著差異(P<0.05)。見表5。

表4 CIK與DC-CIK分泌的細胞因子

與CIK相比：1)P<0.05

表5 兩組腫瘤治療效果〔n(%)，n=13〕

4 討 論

生物工程技術與腫瘤免疫學科結合形成一種嶄新的生物治療方式，又稱為細胞免疫治療〔7〕。以調動宿主原生防衛機制或者給予機體特定物質實現抗腫瘤效應，本質上是采用生物反應調節劑改善患者抵抗力，令機體具備殺傷、抑制腫瘤的功能。

CIK研究顯示，利用人體外周血或者單個核細胞在體外與細胞因子結合、與CD3共同培養得到異質細胞，即自然殺傷細胞樣T淋巴細胞，CIK占比為1.1%～5.1%。使用CIK進行抗腫瘤免疫治療后，以往免疫療法存在體外增殖細胞數量不足、效果不顯著、副作用多的缺點得到改善，且基本不需注射IL-2〔8〕。迄今，研究未確定CIK殺傷靶細胞的原理，估計為腫瘤細胞和黏附因子結合后產生BLT酯酶顆粒，靶細胞膜被顆粒刺破后腫瘤細胞破裂；同時，IL-2、IL-6、TNF-α、GM-CSF是CIK細胞分泌的主要細胞因子，提升CIK誘導、殺傷腫瘤細胞的能力。

DC-CIK抗腫瘤療效表現為：效應細胞殺傷腫瘤靶細胞的能力增強、免疫效應細胞抗腫瘤活性提升。DC-CIK存在增殖速度快、殺瘤活性高的優勢，并且殺傷腫瘤細胞的同時不傷害機體免疫系統結構與功能，改善機體免疫功能〔9〕。DC-CIK回輸治療采血量少、副作用小、適用于大部分腫瘤患者，同時治療效果顯著。采用DC-CIK治療惡性腫瘤過程中，醫護人員應密切觀察患者的狀態與治療反應〔10〕。已知具備最強抗原遞呈能力的抗原遞呈細胞為DC，在刺激幼稚T細胞活化與誘導特異性抗原免疫反應方面效果顯著。免疫治療腫瘤的關鍵是CIK與DC，CIK利用細胞毒功能與分泌性能因子殺傷腫瘤細胞，DC負責辨識病原并激活獲得性免疫系統。

發熱是DC-CIK在抗腫瘤生長過程中容易出現的不良反應，由于回輸CIK懸液中存在IL-2與人血白蛋白導致患者發熱。所以，使用DC-CIK進行抗腫瘤免疫治療過程中應實時監測患者的體溫、呼吸、血壓及脈搏等各項指標，并準確記錄，以便后續精準分析患者病情。本文顯示，DC-CIK回輸后2.5～10.5 h，小部分患者體溫37.3～40.0℃，較大幅度升高；大部分患者體溫可自然降低，極少數患者復用降低藥后體溫正常，高體溫患者一般持續2.5～6.5 h。采用DC-CIK治療腫瘤時應采取適當措施緩解患者發熱的癥狀，預防措施為患者回輸前30 min左右肌肉注射苯海拉明20 mg、鹽酸異丙嗪25 mg。患者出現發熱癥狀時，在醫護人員指導下加量飲水，保持環境通風。若患者持續發燒40℃以上，在醫生指導下藥物降溫。

相對化療與放療而言，DC-CIK免疫療法治療腫瘤過程中明顯改善患者白細胞降低、貧血等癥狀，患者免疫功能不易受損。