組蛋白去乙酰化酶抑制劑聯合索拉非尼對肝癌細胞增殖與凋亡的影響

郝大林 孫成學 肖福斌 鄧放

(北華大學附屬醫院 1感染肝病科，吉林 吉林 132011；2肝膽胰外科)

我國每年新發肝癌病例約占世界肝癌的45%，肝癌的發病率居世界首位〔1〕。手術治療是目前肝癌的第一線治療方案，但70%確診為肝癌的患者由于肝癌的早期病變惡性程度高、發病隱匿、診斷率低而喪失了手術治療的機會〔2〕。因此，研究肝癌的非手術治療是當務之急。組蛋白去乙酰化酶(HDAC)抑制劑(I)亞甲酰胺異羥肟酸(SAHA)和索拉非尼(SRFN)是臨床上常用的治療肝癌的藥物，主要用于治療一些無法通過手術治療的肝癌患者〔3,4〕。 雖然HDACI或SRFN可以單獨用于治療肝細胞癌(HCC)，但最近的研究表明，聯合應用SAHA和SRFN可以提高療效，減少毒副作用，達到綜合治療HCC的效果〔5〕。然而，合理組合用藥的基礎是深入了解使用藥物的機制。本實驗擬研究SAHA、SRFN和SAHA聯合SRFN對HepG2細胞生長、增殖、細胞周期及相關蛋白表達的影響，探討SAHA與SRFN協同作用的可能機制。

1 材料與方法

1.1細胞培養與分組 HepG2 細胞株(購自中國科學院上海細胞生物研究所細胞庫)放置于 37℃、二氧化碳濃度為5%的孵育箱中進行培養。培養基的組成成分為含10%滅活小牛血清的 RPMI1640 及含 1%的青霉素與鏈霉素雙抗。細胞為上皮樣細胞，傳代頻率為2～3 d/次，取對數生長期的細胞為研究樣本。分為4組：對照組、SAHA(1.5 μmol/L SAHA處理)、SRFN(1.5 μmol/L SRFN處理)和SAHA聯合SRFN(1.5 μmol/L SAHA和1.5 μmol/L SAHA處理)。

1.2噻唑藍(MTT)法檢測細胞生長 將HepG2細胞以5×104個細胞/孔接種到96孔板上，分別用0.1、0.5、1.0、1.5及2.5 μmol/L不同濃度的SAHA或SRFN處理HepG2細胞24、48、72 h，以0 μmol/L的SAHA或SRFN處理細胞24、48或72 h為對照組。MTT試劑盒經標準化處理后，在570 nm處測量每個孔的光密度(OD)。每組設4個孔，重復3次。平均OD值作為最終OD值。SAHA或SRFN對HepG2細胞增殖的抑制率=(OD對照-OD處理)/OD對照×100%。

1.3流式細胞術檢測各組細胞周期及凋亡 將各組處理72 h后細胞用胰蛋白酶〔不含乙二胺四乙酸(EDTA)〕消化，磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌細胞2次(2 000 r/min離心5 min)，收集(1～5)×105細胞，加入500 μl的結合緩沖液懸浮細胞，加入5 μl的Annexin V-異硫氰酸熒光素(FITC)混勻，再加入5 μl碘化丙啶混勻，室溫下避光反應15 min。流式細胞儀檢測，激發波長Ex=488 nm，發射波長Em=530 nm。采用FCSExpress3.0軟件進行分析處理，計算細胞凋亡率及細胞周期情況。

1.4Western印跡檢測不同處理組細胞中蛋白水平的表達 用SAHA、SRFN或SAHA聯合SRFN處理后，以細胞總蛋白提取試劑盒提取HepG2細胞的總蛋白。用二喹啉甲酸(BCA)蛋白測定試劑盒測定蛋白質濃度。用十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分離總蛋白(100 μg)轉移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜，依次經過封閉、一抗孵育、洗膜、辣根過氧化物酶耦聯的二抗孵育、洗膜，最后采用化學發光顯色試劑顯影并攝像，并進行分析。

1.5統計學處理 采用SPSS19.0軟件進行t檢驗。

2 結 果

2.1SAHA、SRFN或SAHA聯合SRFN對HepG2細胞增殖的影響 SAHA或SRFN以濃度/時間依賴性抑制HepG2細胞增殖，見圖1。同時SAHA聯合SRFN增強抗增殖作用，見表1。

2.2SAHA、SRFN和SAHA聯合SRFN對HepG2細胞周期和凋亡的影響 SAHA或SRFN誘導HepG2細胞的G0/G1期阻滯。與對照組相比，SAHA組和SRFN組細胞周期G0/G1期分別增加87.16或68.81%。SAHA聯合SRFN組細胞周期G0/G1期比SAHA組增加11.76%，比SRFN組增加23.91%，見表2。SAHA或SRFN組HepG2細胞凋亡率(19.21%±2.96%、12.86%±3.12%)明顯高于對照組(4.64%±0.35%，P<0.05)，但顯著低于SAHA聯合SRFN組(31.22%±3.65%，P<0.05)。

圖1 不同濃度處理后不同時間點SAHA和SRFN對HepG2細胞增殖的抑制作用

SAHA濃度(μmol/L)0.00.10.51.01.52.5SRFN濃度(μmol/L)0.0-10.09±2.0119.17±2.1521.84±1.8829.75±2.8939.23±2.530.13.07±0.4611.38±1.9420.97±1.5923.64±2.3630.28±1.1341.44±2.180.511.37±1.2416.68±3.3423.67±3.6426.79±3.4538.02±2.9449.96±3.871.016.47±1.9123.41±2.8929.41±1.1835.93±3.6945.01±3.0250.03±3.211.520.76±1.8626.85±3.0335.46±2.8543.48±3.2550.79±2.4653.51±3.842.525.41±2.6730.69±3.7436.72±3.0244.09±3.9449.83±4.0355.64±4.12

表2 SAHA、SRFN或SAHA聯合SRFN對HepG2細胞周期的抑制率(%，n=6)

2.3SAHA、SRFN或SAHA聯合SRFN對HepG2細胞相關蛋白表達的影響 與對照組相比，SAHA或SRFN顯著上調P21表達(P<0.05)。SAHA聯合SRFN組p21蛋白表達顯著高于SAHA或SRFN組(P<0.05)。SAHA或SRFN顯著下調CyclinD1、Bcl-2表達(P<0.05)，而對Bax蛋白表達無明顯影響。SAHA聯合SRFN組CyclinD1、Bcl-2表達顯著低于SAHA或SRFN組(P<0.05)，見圖3和表3。

圖3 SAHA、SRFN或SAHA聯合SRFN組增殖、凋亡相關蛋白表達

表3 SAHA、SRFN或SAHA聯合SRFN組中增殖、凋亡相關蛋白表達的比較

與對照組比較：1)P<0.05;與SAHA+SRFN組比較：2)P<0.05

3 討 論

HDACI是基于表觀遺傳學理論發展起來的一種新型抗腫瘤藥物，具有療效好、無明顯毒副作用的特點〔6〕。HDACI通過抑制HDAC活性、調節組蛋白乙酰化狀態、促進抗腫瘤轉錄因子的轉錄和表達、調節相關信號通路發揮抗腫瘤生物學效應〔7〕。SAHA是第二代酮類羥基酸HDACI，在微分子水平下具有很高的抗腫瘤生物學效應，通過調節基因，提高腫瘤細胞對其他化療的敏感性，從而達到治療癌癥的目的〔5〕。腫瘤細胞的增殖、分化受DNA的調控，盡管SAHA和SRFN的作用靶點不同，但兩者聯合使用可能具有協同抗腫瘤作用。

Cha等〔8〕研究不同抗腫瘤藥物的作用靶點不同，但均通過誘導腫瘤細胞凋亡和改變腫瘤組織內環境而顯示出抗腫瘤活性。細胞周期阻滯與細胞凋亡間有重要聯系。細胞分化相關基因p21通過誘導細胞G1/G0期阻滯而抑制細胞增殖和分化。如果藥物能夠上調腫瘤細胞中p21表達，就會使細胞G1/G0期比例增加，腫瘤細胞增殖就會受到抑制，從而發揮抗腫瘤作用。CyclinD1是重要的推動細胞G1/S期相關基因，在許多腫瘤細胞中均有高表達，抑制其高表達可誘導細胞G1/S期阻滯〔9〕。Bcl-2可通過調節多種因素抑制細胞凋亡。因此，SAHA聯合SRFN通過誘導p21上調和cyclinD1下調，發揮細胞阻滯的作用，進而誘導HepG2細胞凋亡,而Bcl-2下調可促進HepG2細胞凋亡。

SAHA或SRFN通過上調p21蛋白的表達，下調Cyclin D1、Bcl-2蛋白的表達，抑制HepG2細胞增殖，促進細胞凋亡。同時，SAHA和SRFN之間存在協同和疊加效應。