艾地苯醌對血管性癡呆大鼠海馬BDNF mRNA及受體TrkB mRNA表達的影響

錢旭東 王東 徐倩倩 李國蕓 王紅梅 張曉璇 馬征

(承德醫學院附屬醫院 1神經內科，河北 承德 067000；2呼吸內科)

血管性癡呆(VD)發生的原因主要與腦血管因素有關，其發生基礎為腦組織受損而引發神經功能異常〔1，2〕。艾地苯醌對改善多種神經系統疾病造成的認知功能下降、VD治療方面有重要的臨床作用〔3～5〕。本實驗擬分析艾地苯醌對VD大鼠海馬腦源性神經營養因子(BDNF)mRNA及高親和力受體酪氨酸激酶(Trk)B mRNA表達的影響。

1 材料與方法

1.1研究對象 選取100只雄性7周齡健康清潔級SD大鼠〔許可證號：SCXK(冀)2008-1-003，合格證號：1404010，河北醫科大學實驗動物中心提供〕，體重250～300 g。每5只放到1個籠子中飼養，維持濕度50%～70%，維持室溫為20～25℃，給予顆粒型普通大鼠飼料，造模前予以適應性喂養1 w。

1.2主要試劑和儀器 TaqMan?RNA反轉錄試劑盒(美國ABI公司，Lot：20170634)，總RNA抽提試劑盒(No：K0731，美國賽默飛生物公司)，凝膠圖像分析系統(Biosens SC710，美國BIOTOP公司)，熒光定量PCR儀(LightCycler480，美國羅氏生物)，低速離心機(TDL5，上海安亭科學儀器廠)，miScript Ⅱ反轉錄試劑盒(上海凱杰生物公司)，山羊抗小鼠〔辣根過氧化物酶(HRP)標記的二抗，上海Abcam公司，貨號ab6789〕，Western印跡電化學發光(ECL)檢測試劑盒(Bio-Rad公司，貨號170-5060)，ZS-001 Moriss 水迷宮(北京眾實迪創科技發展有限公司)，BDNF抗體、TrkB抗體(武漢博士德公司生產)；PCR擴增引物(上海生工公司生產)。

1.3建立模型及分組 模型建立方法：兩血管阻斷法(2-VO)。術前大鼠禁食12 h，禁水4 h，后腹腔注射10% 水合氯醛(3.5 ml/kg)麻醉大鼠，選取頸部正中為切口，將雙側頸總動脈進行分離后用4 號絲線結扎，最后將皮膚縫合并在傷口處注射慶大霉素(0.2萬U)，以便減小感染發生率，分離假手術組雙側頸動脈。艾地苯醌高劑量組、艾地苯醌低劑量組、對照組在建立模型后第3天進行藥物干預，艾地苯醌高劑量組灌服10 mg/kg艾地苯醌，艾地苯醌低劑量組灌服3 mg/kg艾地苯醌，對照組灌服11.06 mg/kg尼莫地平。模型組、假手術組灌服生理鹽水，保持灌服10 ml/kg，1次/d，連續灌服1個月。藥物干預、建立模型完成后剔除死亡大鼠，最終假手術組、艾地苯醌高劑量組、艾地苯醌低劑量組、對照組各20只。

1.4檢測大鼠學習記憶能力情況 藥物干預1個月后，Morris 水迷宮測試所有大鼠，共測試6 d，在前5 d只需測試定位航行，第6天測試空間探索。保持水深35 cm，水溫22℃，追蹤大鼠應用攝像頭。對采集的所有圖像、視頻等及時導入電腦并對分析數據。定位航行水點標記標準：將每一象限的中點作為水點進行標記，在大鼠找平臺位置的前2 min進行記錄，將平臺上停留時間>2 s作為逃避潛伏期。1 d記錄4次，最后計算出平均值。空間探索:將平臺拿走后選擇任何一個水點將大鼠放入，記錄2 min內大鼠跨越平臺的總次數，同時記錄停留時間。

1.5Western印跡測定BDNF、TrkB蛋白水平 選取腦組織：將所有大鼠處死后取出腦組織，應用刀片切開，將完整的左右雙側海馬進行鈍性分離，后將左側海馬組織及時放入液氮中冷凍1 h，后將其放入-80℃超低溫冰箱中。取約100 mg 組織后加入1 ml 10×蛋白變性緩沖液，100℃變性5 min，后將變性溶液加入10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)內，將溶液置入90 V恒壓中進行100 min電泳，當溴酚蘭跑出變性膠后停止電泳，后進行轉模。恒流轉移：在酸纖維素膜上放上SDS-PAGE后，轉膜成功進行封閉(3%BSA)，封閉后將其放在4℃環境下一夜，第2天磷酸鹽緩沖液(PBS)沖洗硝酸纖維素膜，按1∶500的比例將BDNF單克隆抗體加入其中，后在室溫下孵育45 min，孵育完成PBS沖洗硝酸纖維素膜；后對二抗進行孵育，按1∶1 000的比例將HRP標記的二抗加入其中，后室溫下孵育30 min，之后應用PBS沖洗硝酸纖維素膜，進行化學發光，后使用Kodak X曝光3 min進行成像操作。檢測各條帶吸光度值，內參照為β-actin，BDNF相對表達量應用灰度值表示，后采用同樣方法檢測組織中TrkB的表達。

1.6熒光定量PCR檢測BDNF、TrkB mRNA的表達 組織RNA提取：-80℃超低溫冰箱中取出海馬組織，研缽中迅速磨成粉末狀；取出100 mg粉末加入含有1 ml Trizol裂解液的EP管中，混合均勻；室溫靜止5 min，加入200 μl氯仿，充分混勻，室溫放置10 min；4℃離心分取上層水相，并放置RNase-free 1.5 ml離心管內，后加入等量的異丙醇充分震蕩，然后在冰上放置約30 min；取出離心管，再4℃離心分取得到RNA沉淀；應用500 μl 75%酒精洗滌RNA沉淀2次，風干；再加入50 μl RNase-free水在室溫下溶解RNA；應用NanoDrop檢測提取的RNA濃度，完成后將其放置-20℃條件下備用。

檢測定量PCR：對抽取的RNA進行體外反轉錄實驗，最終得到產物cDNA，操作時嚴格按照說明書進行；16℃條件下孵育30 min，42℃條件下孵育30 min，后85℃條件下加熱5 min，后放置4℃條件下保存。將cDNA作為模板進行熒光定量PCR檢測，反應體系為TaqMan?Universal PCR Master Mix 20 μl，操作儀器為羅氏LightCycler480，內參照為β-actin表達水平,ΔCT為BDNF相對值，ΔCT=CTβ-actin-CTBDNF，引物信息為BDNF：上游引物：5'-AGGGGCATAGACAATCG-3',下游引物:5'-TTCCCCTTGATAATGGTC-3';TrkB:上游引物:5'-AGTCGTCGAGACATGTC-3',下游引物:5'-CTGAAGACGGACTGTTG-3;β-actin:上游引物:5'-GCTGTCCCTGTATGCCTC-3',下游引物:5'-AGATGTCAGCGCACGAC-3'。采用同樣的方法檢測TrkB在RNA水平的表達。

1.7統計分析 應用SPSS18.0軟件進行χ2檢驗、方差分析及t檢驗。

2 結 果

2.15組定位航行比較 模型組逃避潛伏期〔(60.24±27.84)s〕顯著長于艾地苯醌低劑量組、艾地苯醌高劑量組、假手術組、對照組〔(42.51±20.12)s、(32.28±17.48)s、(21.37±15.45)s、(33.64±18.32)s，P<0.05〕，假手術組顯著短于艾地苯醌低劑量組、艾地苯醌高劑量組、對照組(P<0.05)；而相比于假手術組，艾地苯醌高劑量組和對照組差異無統計學意義(P>0.05)。

2.25組空間探索結果比較 假手術組穿越原平臺次數、原平臺停留時間明顯多于艾地苯醌低劑量組、艾地苯醌高劑量組、模型組、對照組(P<0.05);模型組均明顯少于艾地苯醌低劑量組、艾地苯醌高劑量組、對照組(P<0.05)。艾地苯醌高劑量組與對照組相比差異無統計學意義(P>0.05)。見表1。

表1 各組模型水迷宮探索結果比較

與假手術組比較：1)P<0.05；與模型組比較：2)P<0.05

2.3各組腦海馬BDNF、TrkB 蛋白表達比較 模型組BDNF、TrkB 蛋白表達水平顯著低于艾地苯醌低劑量組、艾地苯醌高劑量組、假手術組、對照組(P<0.05)。與艾地苯醌高劑量組比較，艾地苯醌低劑量組均顯著降低(P<0.05)。見圖1，表2。

2.4各組腦海馬BDNF mRNA、TrkB mRNA表達比較 模型組TrkB mRNA、BDNF mRNA表達水平顯著低于艾地苯醌低劑量組、艾地苯醌高劑量組、假手術組、對照組(P<0.05)。與假手術組相比，艾地苯醌高劑量組和對照組均無顯著變化(P>0.05);而艾地苯醌低劑量組均顯著低于假手術組(P<0.05)。見表2。

A～E：假手術組、模型組、艾地苯醌低劑量組、艾地苯醌高劑量組、對照組圖1 各組腦海馬BDNF 和TrkB 蛋白表達

表2 各組腦海馬BDNF 和TrkB 蛋白及mRNA表達比較

與模型組比較：1)P<0.05；與艾地苯醌低劑量組比較：2)P<0.05

3 討 論

VD 的發生主要與腦部血管發生病變全腦組織或局部腦組織發生缺氧缺血，最終對腦部認知記憶、神經組織造成損傷顯著相關〔6〕。小腦、海馬體、大腦皮質對缺氧、缺血的敏感度非常高〔7〕。腦部缺血、缺氧導致損傷發生后會引發一系列級聯反應，如氧化應激反應、細胞死亡、炎性反應、梗死周圍去極化、興奮性氨基酸毒性、能量衰竭等，發生反應會對神經遞質的突觸傳遞、調節功能產生影響，進而對神經元造成一定的損傷，且會對學習記憶功能產生很大影響〔8，9〕。有研究表明，艾地苯醌可抑制炎性反應，進而會對小膠質細胞的生長繁殖過程產生抑制作用，從而在治療VD過程中發揮非常重要作用〔10〕。本實驗表明，腦缺血導致神經元損傷是引起癡呆的重要原因，艾地苯醌藥可以有效減輕缺氧、缺血對神經元造成的損傷，可以有效保護海馬神經元。

神經營養因子由多種細胞分泌，對外周神經系統、中樞系統發揮重要作用，它們通過自分泌、旁分泌、靶源分泌等多種形式發揮調節神經系統活動及代謝能力，該因子在修復損傷神經系統方面起著關鍵性作用〔11～13〕。BDNF廣泛存在于腦組織中，其在皮質、海馬體中的含量最多，作用為維持腦缺血后神經元的生長繁殖，促進神經元細胞、神經元軸突、樹突的生長繁殖，促使神經元突觸間遞質的分泌等，同時可以有效改善學習記憶功能，改善VD 認知功能〔14，15〕。BDNF通常與受體TrkB發生特異性結合，進而會增強細胞內酪氨酸激酶的生物活性，誘導TrkB發生磷酸化等，最終會刺激下游信號通路，對神經元進行保護〔16〕。當腦部組織發生缺氧、缺血時，BDNF、受體TrkB 的含量會明顯升高，當BDNF、受體TrkB 含量減少時，會使動物學習記憶受到嚴重損傷〔17〕。本研究結果表明，艾地苯醌可以提高BDNF、受體TrkB水平，可以有效刺激下游信號通道，進而有利于修復受損海馬神經元，最終提高VD 大鼠的學習能力、記憶能力。