miR-200c靶向程序性死亡蛋白配體1基因抑制結腸癌細胞的侵襲能力

孔曉靜

(山東省東明縣中醫醫院內科,山東 東明 274500)

近年來我國結腸癌發病率及病死率呈上升趨勢〔1,2〕，腫瘤逃避機體免疫監視是腫瘤發生發展的重要機制，程序性細胞死亡蛋白 (PD)-1與配體(PD-L1)結合后使T細胞受體信號通路多個關鍵的信號分子去磷酸化，從而抑制免疫應答〔3,4〕，PD-1/PD-L1 抗體藥物納武單抗是目前消化系統腫瘤免疫治療領域的熱點，已有研究報道miRNA 作為表觀遺傳調控的重要成員，通過調控 PD-1/PD-L1的表達抑制腫瘤細胞的增殖與侵襲〔5,6〕，本研究通過免疫組織化學法檢測PD-L1分子在結腸癌組織中的表達狀況，并與臨床病理特征進行相關性分析，初步探索 miR-200c靶向調控PD-L1基因對結腸癌細胞侵襲能力的影響。

1 材料與方法

1.1研究對象 收集山東省東明縣中醫醫院2016年1月至2017年12月行結腸癌根治術47例患者的癌組織、癌旁組織(距腫瘤邊緣大于5 cm)組織標本，47例患者中男32例，女15例，平均年齡(52.6±8.4)歲，升結腸癌17例，橫結腸癌5例，降結腸癌13例、乙狀結腸癌12例，患者均為初始治療，術前未接受放化療治療，術后病理證實為結腸惡性腫瘤。結腸癌LoVo細胞購自中科院上海細胞庫。

1.2主要試劑 10%胎牛血清、DMEM 培養液(美國Gibco公司)、 LipofectamineTM3000脂質體、miR-200c模擬物(上海生工生物工程有限公司合成)、侵襲小室(美國Sigma公司)、雙熒光報告基因檢測試劑盒(美國Promega公司)、鼠抗PD-L、二氨基聯苯胺(DAB)顯色試劑盒均購自福州邁新生物技術開發有限公司。

1.3免疫組化法檢測結腸癌組織中PD-L1蛋白的表達 取47例結腸癌患者手術標本，常規、脫蠟水化、高溫抗原修復、封閉，加入兔抗人PD-L1單克隆抗體、二抗孵育、DAB顯色、蘇木精復染、封片，結腸癌組織標本的免疫組化切片均由2名資深病理科醫生獨立雙盲觀察，細胞內出現棕黃色顆粒者為陽性。

1.4細胞培養與轉染 將結腸癌LoVo細胞培養于添加10%胎牛血清的DMEM培基中，37℃、5%CO2的培養箱中孵育培養，通過TargetScan 靶基因預測庫預測 miR-200c能與PD-L1 的3′-UTR 結合，取對數生長期結腸癌LoVo細胞，0.25%胰酶消化后將細胞分成3組，轉染組轉染 miR-200c mimic，陰性對照組轉染 miR-NC，空白對照組為正常培養LoVo細胞。將上述3組細胞利用LipofectamineTM3000脂質體轉染后，根據Trizol試劑盒說明書提取總RNA，按照Invitrogen試劑盒說明書進行反轉錄反應、擴增，以β-actin為內參，用Real-time PCR法檢測細胞中miR-200c、PD-L1 mRNA的表達，miR-200c、PD-L1的引物序列見表1。

表1 β-actin、miR-200c、PD-L1的引物序列

1.5熒光素酶報告基因檢測各組雙熒光素酶活性 將含有miR-200c結合位點PD-L1的3′-UTR片段插入pGL-3熒光素酶報告基因載體，構建野生型和突變型的熒光素酶報告載體，分別將miR-200c、miR-NC和pGL-3熒光素酶報告載體共轉染結腸癌LoVo細胞，共3組細胞：①miR-200c mimic+pGL-3 PD-L1 3′-UTR-Wt(轉染組)；②miR-NC mimic+pGL-3 PD-L1 3′-UTR-Wt(陰性對照組)；③空白對照組細胞，置于37℃、5%CO2培養箱中繼續培養24 h，按照Promega公司雙熒光素酶檢測方法進行檢測。

1.6Transwell法檢測細胞侵襲能力 將轉染組轉染 miR-200c mimic，陰性對照組轉染 miR-NC，空白對照組為正常培養LoVo細胞進行轉染48 h后，0.25%胰酶消化，接種到Transwell上室后加入DMEM培養基，下室加入500 μl含10%胎牛血清的DMEM培養基，培養箱中培養48 h后，取出 Transwell小室，沖洗、固定、染色后，倒置顯微鏡下觀察計數。

1.7統計方法 采用SPSS18.0統計軟件進行t檢驗、方差分析，PD-L1與臨床病理特征的相關性分析采用χ2檢驗。

2 結 果

2.1PD-L1在結腸癌組織中的表達及與臨床病理特征的關系 PD-L1主要表達于腫瘤細胞和淋巴細胞(圖1)，結腸癌組織中PD-L1蛋白表達陽性率為55.3%(26/47)，顯著高于癌旁組織〔27.7%(13/47)〕，差異有統計學意義(χ2=7.406，P=0.006 5)。結腸癌組織中PD-L1蛋白表達與腫瘤分化(χ2=6.021，P=0.031 2)、pN分期(χ2=7.141，P=0.003 7)、T分期有關(χ2=8.073，P=0.044 5)，與患者年齡、性別、腫瘤最大徑、腫瘤部位無明顯相關性(表2)。

圖1 PD-L1在結腸癌組織中的表達(DAB，×400)

表2 PD-L1表達與臨床病理特征的相關性(n)

2.2miR-200c靶向調控結腸癌LoVo細胞PD-L1的表達 轉染組轉染 miR-200c mimic后，細胞內miR-200c的表達明顯上升，miR-200c水平(2.23±0.52)較空白對照組(0.43±0.12)、陰性對照組(0.51±0.15)明顯升高，差異有統計學意義(F=57.45，P<0.000 1)，表明miR-200c mimic在結腸癌LoVo細胞中高表達，已成功轉染 miR-200c mimic。miR-200c mimic轉染后，細胞內PD-L1的表達下降至(0.27±0.06)，與空白對照組(1.12±0.38)、陰性對照組(1.35±0.44)有統計學差異(F=19.14，P=0.000 2)。miR-200c mimic轉染組熒光素酶活性(0.38±0.11)，明顯低于空白對照組(1.01±0.09)、陰性對照組(1.05±0.10)，差異有統計學意義(F=118.2，P<0.000 1)。

2.3miR-200c對LoVo細胞侵襲能力的影響 miR-200c mimics 轉染結腸癌 LoVo細胞48 h后，細胞遷移數目(156±43.6)明顯低于空白對照組(239±59.8)、陰性對照組(274±61.9)，差異有統計學意義(F=7.102，P=0.006 8)。

3 討 論

腫瘤免疫治療通過活化特異性T淋巴細胞，激活和增強機體對腫瘤細胞的免疫應答，是最新而且有效的腫瘤治療手段〔7，8〕。PD-1是表達于T細胞表面的負共刺激信號分子，活化的PD-1通過與配體PD-L1結合，募集蛋白酪氨酸磷酸酶，使T細胞受體信號關鍵分子去磷酸化，抑制抑制免疫應答〔3～5，9〕，多項研究證實PD-L1在胃癌、肝細胞癌等實體腫瘤中呈過表達狀態〔10～12〕。我們的研究發現47例結腸癌組織中PD-L1蛋白表達與腫瘤分化程度、淋巴結轉移、浸潤深度有關，與患者年齡、性別、腫瘤直徑大小、腫瘤部位無明顯相關性，提示PD-L1可能與結腸癌的發生發展有關。

PD-L1是一種由290個氨基酸構成的跨膜蛋白，基因定位于染色體9p24，胞外區含有與PD-1結合的結構域〔13〕。miR-200c是miR-200 家族成員之一，與家族成員miR-141成簇定位于染色體12p13，miR-200 家族通過參與腫瘤轉移的上皮-間質轉化過程〔14，15〕，有研究證實miR-200b通過靶向PD-L1 3′-UTR抑制胃癌細胞內 PD-L1的表達〔16〕，提示miR-200 家族成員可能通過抑制PD-L1發揮其抑癌基因的作用。本研究通過脂質體使結腸癌LoVo細胞過表達miR-200c后，進一步證實miR-200c在結腸癌中靶向下調PD-L1，與腫瘤的發生發展、浸潤轉移有關，推測其原因可能與miR-200c下調PD-L1后，結腸癌腫瘤轉移和免疫逃逸能力增強，提示miR-200c介導的PD-L1基因沉默可能與結腸癌的轉移侵襲有關，然而其具體機制仍有待進一步研究。結腸癌是發病率較高的消化道惡性腫瘤，一項多中心結腸癌患者臨床Ⅱ期試驗證實，PD-1/PD-L1抑制劑Pembrolizumab對氟嘧啶或伊立替康治療失敗的結腸癌患者，具有較高的疾病控制率，可能是結腸癌患者免疫治療的新方向〔17〕。免疫治療在最新腫瘤治療中嶄露頭角，免疫檢測點PD-1及其配體PD-L1誘導免疫耐受是腫瘤免疫逃逸的關鍵分子，雖然目前PD-1/PD-L1抑制劑Nivolumab和Pembrolizumab在消化道腫瘤的治療中應用廣泛，但其機制仍有待于從細胞分子、基因水平進一步加以探索，本研究發現，PD-L1在結腸癌組織中高表達，且與腫瘤分化、淋巴結轉移、浸潤深度有關，miR-200c通過靶向結腸癌LoVo細胞內PD-L1 3′-UTR抑制PD-L1的表達，上調miR-200c表達可抑制結腸癌LoVo細胞侵襲能力。