雙向調(diào)控FABP-5表達(dá)對人卵巢癌SKOV3細(xì)胞裸鼠移植瘤放射敏感性的影響

錢林華

(浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬婦產(chǎn)科醫(yī)院婦產(chǎn)科，浙江 杭州 310006)

卵巢癌是目前全球發(fā)病率較高的婦科惡性腫瘤疾病之一，該病的死亡率更是居于全世界婦科疾病第一位〔1～3〕。由于卵巢癌在發(fā)病初期缺乏特定的征象，因此該疾病在診斷時確診非常之困難。即使卵巢癌病灶發(fā)現(xiàn)較早，其患者的術(shù)后生存率仍不理想，主要是由于手術(shù)只能切除肉眼可見的病灶，對于隱匿的轉(zhuǎn)移灶則無作用。而且相當(dāng)一部分的患者往往在確診時病情就已經(jīng)發(fā)展到了中晚期，從而失去了手術(shù)根除的機(jī)會。對于卵巢癌患者而言，放射線治療成為卵巢癌重要的輔助手段之一。臨床上卵巢癌的放療效果比較有限，其主要原因在于卵巢癌細(xì)胞對放射線的敏感性較低〔4,5〕。據(jù)此可知，研究提高卵巢癌細(xì)胞放射敏感性的手段以提高其放射治療的療效意義重大。表皮型脂肪酸結(jié)合蛋白(FABP)-5能夠通過脂肪酸代謝產(chǎn)物調(diào)控腫瘤細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，促進(jìn)細(xì)胞的增殖活化；研究發(fā)現(xiàn)在原發(fā)性肝癌、前列腺癌、乳腺癌、膀胱癌等癌細(xì)胞異常增殖時該蛋白表達(dá)顯著上調(diào)〔6～12〕。Ogawa等〔13〕報(bào)道，腫瘤細(xì)胞可以通過上調(diào)FABP-5基因表達(dá)，來鈍化其射線敏感性，抵抗射線的殺傷作用。目前就卵巢癌癌細(xì)胞中FABP-5基因和蛋白相對表達(dá)水平與卵巢癌細(xì)胞放射敏感性關(guān)系的研究還比較缺乏。本研究旨在通過雙向調(diào)控卵巢癌細(xì)胞中的FABP-5表達(dá)，探討FABP-5表達(dá)與卵巢癌細(xì)胞放射敏感性的關(guān)系，為卵巢癌細(xì)胞的放射治療提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)細(xì)胞及儀器、實(shí)驗(yàn)動物 卵巢癌組織來自浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)附屬婦產(chǎn)科醫(yī)院2015年4月至2016年6月婦產(chǎn)科收治住院并接受手術(shù)切除的新鮮標(biāo)本，且患者術(shù)前均未行放療及化療。術(shù)后于浙江省實(shí)驗(yàn)動物中心將每例所取癌及其周圍的正常組織(癌緣5 cm)于液氮保存?zhèn)溆谩２±龢?biāo)本均經(jīng)病理學(xué)證實(shí)為卵巢癌。該研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準(zhǔn)，患者皆知情同意。超凈工作臺(藝斯高貿(mào)易有限公司)，F(xiàn)ABP-5兔抗人多克隆抗體，辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的山羊抗兔多克隆抗體；GAPDH為小鼠抗人單克隆抗體，均來自艾康生物技術(shù)(杭州)有限公司。胎牛血清、磷酸緩沖液(PBS)、DMEM培養(yǎng)基、胰蛋白酶購于Hyclone公司；細(xì)胞培養(yǎng)箱(Heraeus Sepatech 公司生產(chǎn))。Trizol試劑盒(Invitrogen生產(chǎn))；十二烷基硫酸鈉(SDS)蛋白上樣緩沖液、二喹啉甲酸(BCA)蛋白濃度測試試劑盒(北京益德益華生物有限公司)、TBS緩沖液(南京建成生物)。人卵巢癌SKOV3細(xì)胞購于中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院。30只雄性成年BALB/C裸鼠〔7～8周齡，裸鼠體重為(18±2)g〕由浙江省實(shí)驗(yàn)動物中心提供，室溫25℃，濕度50%～80%，SPF環(huán)境下自由飲水和采食，生產(chǎn)許可證號為SCXK(浙)2008-0118。

1.3卵巢癌及癌旁組織中FABP-5 mRNA與蛋白的相對表達(dá) 采用實(shí)時聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)和Western印跡分別測定各個配對組織標(biāo)本FABP-5基因和蛋白表達(dá)，重復(fù)3次。用Oligo7.6 Demo軟件行引物設(shè)計(jì)，F(xiàn)ABP-5正向：5'-TGAAGGAGCTAGGAGTGGGAA-3'，反向：5'-TGCACCATCTGTAAAGTTGCAG-3'，擴(kuò)增長度212 bp；GAPDH正向：5'-TGACTTCAACAGCGACACCCA-3'，反向：5'-CACCCTGTTGCTGTAGCCAAA-3'，擴(kuò)增長度121 bp。提取總RNA后逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，通過2-ΔΔCt分析法，按內(nèi)參基因GAPDH測定FABP-5 mRNA相對表達(dá)水平。取配對卵巢癌樣本，依據(jù)二喹啉甲酸(BCA)試劑盒提取并對組織中FABP-5蛋白濃度進(jìn)行測定，將組織裂解后并將之稀釋至同等的蛋白濃度后，5 min 100℃煮沸使蛋白變性，取蛋白40 μg/組，10%的SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)(70 V，30 min；100 V，90 min)后；轉(zhuǎn)至聚偏氟乙烯(PVDF)膜(200 mA，3 h)；室溫下5%的脫脂牛奶2 h(或4℃過夜)封閉；一抗1∶500，4℃過夜(或室溫下孵育2 h)；含5%脫脂奶粉的PBS(TPBS)3次洗滌，PBS洗滌1次；后行蛋白免疫印跡反應(yīng)，拍照記錄后行軟件圖像分析，測定FABP-5蛋白質(zhì)相對表達(dá)水平。

1.4卵巢癌SKOV3細(xì)胞體外培養(yǎng)建立實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ图胺纸M 將凍存的SKOV3人卵巢癌細(xì)胞于37℃的恒溫水浴箱，30 s內(nèi)行快速復(fù)蘇。融化后即刻將細(xì)胞轉(zhuǎn)至EP管內(nèi)并向管中加入DMEM培養(yǎng)基，多次輕柔吹打，使細(xì)胞均勻分布，離心后棄去上清。復(fù)蘇后的SKOV3細(xì)胞通過DMEM完全培養(yǎng)基調(diào)整細(xì)胞濃度為1×106/ml備用。將人卵巢癌SKOV3細(xì)胞隨機(jī)平均分為3組:對照組(不實(shí)施任何基因轉(zhuǎn)染)、FABP-5上調(diào)組(將pcDNA3.1-FABP-5進(jìn)行基因轉(zhuǎn)染)、FABP-5下調(diào)組(將FABP-5 siRNA進(jìn)行基因轉(zhuǎn)染)。

1.5采用電穿孔法進(jìn)行基因轉(zhuǎn)染 FABP-5 siRNA和pcDNA3.1-FABP-5分別由上海生工生物有限公司合成提供。取生長對數(shù)期人卵巢癌細(xì)胞行胰蛋白酶消化后收集細(xì)胞，通過羥乙基哌嗪乙硫磺酸(HeBS)液(NaCl 140 mmol/L， KCl 5 mmol/L，葡萄糖6 mmol/L ，Na2HPO40.75 mmol/L ， Hepes 25 mmol/L)行重懸、計(jì)數(shù)后，調(diào)整細(xì)胞密度至5×106/ml，取200 μl細(xì)胞液/次加入電擊杯，分別向?qū)φ战M、上調(diào)組和下調(diào)組中分別加入4 μg生理鹽水、pcDNA3.1-FABP-5、FABP-5 siRNA；電轉(zhuǎn)后于室溫下2 min靜置，然后將3組SKOV3細(xì)胞分別置于3份6孔細(xì)胞培養(yǎng)板和96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中(含2 ml細(xì)胞培養(yǎng)液)，于細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。取出3組細(xì)胞，棄去培養(yǎng)基后加入含800 μg/ml G418的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)；定期細(xì)胞換液更換并篩選培養(yǎng)基，當(dāng)細(xì)胞出現(xiàn)大量死亡，將G418的濃度減半后繼續(xù)培養(yǎng)篩選；培養(yǎng)10～14 d后，顯微鏡下觀察有穩(wěn)定的抗性克隆后停藥，對細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)。

1.6RT-PCR和Western印跡檢測細(xì)胞中FABP-5 mRNA和蛋白的表達(dá) 轉(zhuǎn)染48 h后取3組細(xì)胞，方法同1.3。

1.7CCK-8試劑盒檢測細(xì)胞的增殖 在SKOV3細(xì)胞基因轉(zhuǎn)染后繼續(xù)培養(yǎng)48 h，通過CCK-8法對卵巢癌細(xì)胞的增殖活化能力進(jìn)行測定。轉(zhuǎn)染48 h后，分別收集3組細(xì)胞后接種于96孔板上，每個處理設(shè)3個復(fù)孔；繼續(xù)培養(yǎng)箱中細(xì)胞培養(yǎng)，細(xì)胞貼壁后再培養(yǎng)48 h，分別加 CCK-8試劑20 μl/孔后，振蕩搖勻；將處理后的細(xì)胞于細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1.0～1.5 h后，之后取出細(xì)胞通過酶標(biāo)儀測定OD490值。

1.8克隆形成實(shí)驗(yàn)觀察各組SKOV細(xì)胞的放射敏感性 轉(zhuǎn)染后48 h，3組細(xì)胞經(jīng)消化、細(xì)胞計(jì)數(shù)后，分別接種于6孔培養(yǎng)板中；繼續(xù)培養(yǎng)24～30 h，對3組細(xì)胞分別給予不同劑量Gy的單劑量照射(6 MV X射線，照射野為30×30 cm2，源皮距為100 cm)，放射后細(xì)胞靜置培養(yǎng)14 d，通過1%的結(jié)晶紫固定液20 min固定后，顯微鏡下計(jì)數(shù)≥50個細(xì)胞克隆。通過Sigmaplot12.0軟件行細(xì)胞存活曲線擬合，并對放射敏感性參數(shù)D0、外推數(shù)N值和照射2 Gy時細(xì)胞的存活率(SF2)進(jìn)行計(jì)算。

1.9TUNEL檢測細(xì)胞凋亡 轉(zhuǎn)染后48 h，將細(xì)胞取出培養(yǎng)箱后測定各組中SKOV3細(xì)胞凋亡情況。首先，輕輕吹打使細(xì)胞均勻分布，細(xì)胞洗滌后，滴加50 μl原位末端標(biāo)記反應(yīng)混合液，于濕盒中37℃下孵育1 h，滴加POD2轉(zhuǎn)化液50 μl，濕盒37℃孵育30 min，通過PBS(pH7.4)3次沖洗后，二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色后，通過HE進(jìn)行細(xì)胞復(fù)染后在顯微鏡下行圖像分析，細(xì)胞核棕黃色的細(xì)胞為凋亡細(xì)胞，計(jì)數(shù)總細(xì)胞數(shù)及凋亡細(xì)胞數(shù)，并計(jì)算細(xì)胞凋亡率。

1.10檢測調(diào)控FABP-5表達(dá)后X射線照射對卵巢癌細(xì)胞生長的影響 選取體重及日齡均相近的裸鼠30只，隨機(jī)平均分為3組，對照組10只、FABP-5下調(diào)組10只和FABP-5上調(diào)組10只。取轉(zhuǎn)染48 h后的各組細(xì)胞，通過胰酶消化重懸后，別接行相應(yīng)組裸鼠右腋皮下0.5 cm處接種。裸鼠于通風(fēng)、無菌、潔凈的SPF級動物房飼養(yǎng)，接種約1 w，在裸鼠右腋接種區(qū)可見米粒大小的移植瘤；各組裸鼠麻醉滿意后固定于解剖板上，放療(20 Gy X射線照射)40 d后處死裸鼠，分離右腋腫瘤組織后，計(jì)算瘤塊體積。

1.11統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS17.0軟件進(jìn)行單因素方差(One-way ANOVA)分析和t檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1卵巢癌及癌旁組織中FABP-5 mRNA與蛋白的表達(dá) 卵巢癌組織和蛋白的相對表達(dá)水平明顯較癌旁組織高(P<0.05)。見圖1、表1。

2.2FABP-5 mRNA和蛋白的表達(dá) 與對照組相比,FABP-5下調(diào)組細(xì)胞FABP-5 mRNA和蛋白相對表達(dá)水平顯著較低，F(xiàn)ABP-5上調(diào)組SKOV3細(xì)胞FABP-5 mRNA和蛋白表達(dá)顯著較高(P<0.05)。見圖2、表2。

圖1 卵巢癌及癌旁組織FABP-5 mRNA與蛋白表達(dá)

表1 卵巢癌及癌旁組織中FABP-5 mRNA與蛋白的表達(dá)

圖2 轉(zhuǎn)染48 h后各組FABP-5 mRNA和蛋白表達(dá)

表2 轉(zhuǎn)染后FABP-5 mRNA和蛋白表達(dá)

與對照組比較：1)P<0.05；表3、表4同

2.3細(xì)胞的增殖 與對照組相比，F(xiàn)ABP-5下調(diào)組癌細(xì)胞增殖水平顯著降低(P<0.05)，而FABP-5上調(diào)組中卵巢癌細(xì)胞的增殖水平明顯較FABP-5上調(diào)組升高(P<0.05)。見表3。

2.4卵巢癌細(xì)胞株SKOV3的放射敏感性 與對照組相比，F(xiàn)ABP-5下調(diào)組細(xì)胞平均致死劑量D0、SF2和N值明顯降低，F(xiàn)ABP-5上調(diào)組細(xì)胞D0、SF2和N值顯著升高(P<0.05)。見表4。

表3 轉(zhuǎn)染后各時間點(diǎn)各組細(xì)胞增殖率的變化

表4 卵巢癌細(xì)胞株SKOV3的放射敏感性

2.5細(xì)胞凋亡 與對照組〔(25.4±1.2)%〕比較，F(xiàn)ABP-5下調(diào)組卵巢癌SKOV3細(xì)胞凋亡率〔(58.6±0.9)%〕顯著增加(P<0.05)；FABP-5上調(diào)組〔(12.3±0.7)%〕顯著降低(P<0.05)。見圖3。

圖3 TUNEL法染色各組細(xì)胞凋亡(×200)

2.6各組聯(lián)合X射線照射對卵巢癌細(xì)胞的生長抑制 FABP-5上調(diào)組瘤體平均體積顯著大于FABP-5下調(diào)組(P<0.05)。20 Gy X射線照射后FABP-5下調(diào)組瘤體平均體積較照射前明顯減小(P<0.05)；而FABP-5上調(diào)組裸鼠皮下種植瘤平均體積較照射前無明顯變化(P>0.05)。見表5。

表5 X射線照射對卵巢癌細(xì)胞的作用

與FABP-5下調(diào)組比較：1)P<0.05，與照射前比較：2)P<0.05

3 討 論

FABP家族是調(diào)控細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)代謝反應(yīng)的一個蛋白家族，該家族與細(xì)胞代謝和機(jī)體炎癥通路也密切相關(guān)。FABP能夠高親和性地和疏水性基團(tuán)結(jié)合，如與長鏈脂肪酸等脂類物質(zhì)進(jìn)行可逆性結(jié)合。FABP家族的不同成員在機(jī)體內(nèi)不同組織中差異性表達(dá)，其主要參與脂肪酸代謝〔14〕。FABP-5(E-FABP)主要來源于表皮細(xì)胞，近來研究發(fā)現(xiàn)在多種腫瘤細(xì)胞增殖過程中FABP-5基因顯著上調(diào)，這提示FABP-5可能與多種腫瘤性疾病相關(guān)〔15～19〕。研究表明，其參與脂肪酸的胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、基因表達(dá)調(diào)控及運(yùn)輸代謝等〔20〕；結(jié)合并轉(zhuǎn)運(yùn)維甲酸，對過氧化酶體增殖物激活受體(PPAR)β/δ進(jìn)行活化，是細(xì)胞內(nèi)源性的抗氧化物質(zhì)，能夠調(diào)節(jié)細(xì)胞的分化，促進(jìn)增殖并抑制凋亡〔21〕。放療對癌癥細(xì)胞的干預(yù)機(jī)制主要是促進(jìn)胞內(nèi)產(chǎn)生高水平的活性氧(ROS)，后者可干擾DNA形成，降低腫瘤細(xì)胞活力〔22～25〕。而FABP-5是較好的內(nèi)源性抗氧化性劑，可通過提高胞內(nèi)抗氧化酶系統(tǒng)，捕捉或清除ROS，緩解ROS的毒殺作用，此系FABP-5影響卵巢癌細(xì)胞放射敏感性的重要原因〔26～29〕；通過抑制FABP-5表達(dá)，降低了其對ROS的捕捉能力，細(xì)胞內(nèi)抗氧化狀態(tài)下降，細(xì)胞凋亡增加〔30～32〕；細(xì)胞生存能力下降。據(jù)此可知，上調(diào)FABP-5的表達(dá)可能更大程度地降低癌細(xì)胞的放射敏感性，而下調(diào)FABP-5的表達(dá)則可能提高其放射敏感性，進(jìn)而利于放療的效果。

本試驗(yàn)結(jié)果提示雙向調(diào)控FABP-5方法成功。人卵巢癌細(xì)胞的放射敏感性與FABP-5的表達(dá)高低關(guān)系密切，通過基因調(diào)控可以提高癌細(xì)胞的放射敏感性，增強(qiáng)放射治療的療效。