龜板提取物調控毛囊干細胞信號通路促進大鼠壓瘡修復

李春，田瑞敏，李瑜，鐘淑賢

（1.廣州中醫藥大學護理學院，廣東廣州 510006；2.廣東省中醫院，廣東廣州 510006）

壓瘡是皮膚組織長期受壓所致的局限性損傷，嚴重影響患者的生存質量[1]。已知毛囊干細胞（hair follicle stem cells，HFSCs）是皮膚損傷修復中最重要的干細胞來源。當皮膚受損時，HFSCs呈線性方式向傷口中心遷移并增殖分化為上皮細胞、毛囊、皮脂腺等，加快創面愈合[2]。傳統中藥龜板具有滋陰潛陽、益腎健骨功效，民間用于治療皮膚損傷，效果良好。本課題組前期研究[3]發現，龜板提取物（Carapax et Plastrum Testudinis extracts，CPTE）能通過激活Wnt/β-catenin信號通路促進HFSCs增殖，進而修復大鼠觸須部急性皮膚損傷。因此，本研究通過體內外實驗觀察CPTE對大鼠壓瘡皮膚的修復作用及對HFSCs增殖的影響，為臨床應用CPTE治療壓瘡及新藥研發提供實驗基礎。現將研究結果報道如下。

1 材料與方法

1.1 動物 40只SPF級雄性Sprague Dawley（SD）大鼠，體質量200～220 g，由廣州中醫藥大學實驗動物中心提供，動物質量合格證號為44005900002461，用于體內模型制備以及治療方面的研究。新生的SD大鼠（出生24 h內），由廣州中醫藥大學實驗動物中心提供，動物質量合格證號為44005900002457，用于原代細胞培養。

1.2 藥物及試劑 龜板（廣州市藥材中心）；美容用橄欖油（屈臣氏化妝有限公司）。Ⅰ型膠原酶（批號：17100017）、胰蛋白酶（批號：25300-054）、HG-DMEM培養基（批號：12800017）、青鏈霉素混合液（批號：15140-122）、K-SFM培養基[含重組表皮生長因子（rEGF）、牛垂體提取物（BPE）]（批號：17005-042）以上均購自美國Gibco公司；四季青胎牛血清（FBS，浙江天航生物科技股份有限公司，批號：sc-224480）；β-catenin抗體（美國Abcam公司，批號：ab32572）；β-actin抗體（美國Cst公司，批號：2230S）；細胞角蛋白15（CK15）抗體（北京博奧森生物科技有限公司，批號：bs-4762R）、骨形態發生蛋白4（BMP4）抗體（武漢博士德公司，批號：PB0728）；核標記物二脒基苯基吲哚（DAPI）、焦碳酸二乙酯（DEPC；美國Sigma公司，批號分別為D9542MSDS、472S65MSDS）；RIPA裂解液（美國Sigma公司，批號：R0278）；蛋白酶抑制劑（PMSF；上海碧云天生物技術有限公司，批號：P0013B）；堿性成纖維生長因子（bFGF；北京博奧森生物科技有限公司，批號：bs-0217P）；水合氯醛（國藥集團化學試劑有限公司）；多聚甲醛（天津市福晨化學試劑廠）；蔗糖（上海瀚思化工有限公司）。

1.3 儀器 IX73倒置熒光顯微鏡（日本Olympus公司）；電熱恒溫水浴箱（上海一恒科技有限公司）；iMark酶標儀、C1000 PCR儀（美國Bio-Rad公司）；制冰機（意大利Scotsman公司）；低溫離心機（丹麥Labogene公司）。

1.4 CPTE的制備及化學成分 參照本課題組前期制備方法[3]：將龜板低溫粉碎成粗粉，采用體積分數95%乙醇滲透法提取，應用石油醋、乙酸乙醋遞增極性溶劑洗脫，經篩選得到CPTE。經分析鑒定，CPTE的化學成分中含有9種活性成分，分別為十六酸甲酯（12.35%）、十六酸（15.85%）、十六酸乙酯（12.44%）、十八酸（15.56%）、十八酸乙酯（20.64%）、十八酸甲酯（12.77%）、甾酮（3.38%），甾酯（3.35%)、十四酸甾醇酯（3.75%)。

1.5 體內實驗

1.5.1 大鼠壓瘡模型建立及分組 取40只SD大鼠，腹腔注射100 g/L水合氯醛（劑量為0.3 mL·kg-1）；背部皮膚剃毛，將其背部皮膚沿正中線提起，對稱性扣上4片強力磁鐵[4]，磁片直徑18 mm，厚2 mm，每塊磁感應強度0.141 2 T，夾12 h后松開12 h，重復3個循環。最終出現了早期壓瘡的特點，受壓部位皮膚顏色發紅，壓之不褪色。將造模成功的大鼠隨機分為模型對照組，溶劑（橄欖油）對照組，CPTE低、高劑量組（對應質量濃度分別為0.5、5 g·L-1），每組10只。將大鼠分開放置。將CPTE溶于橄欖油中，分別于每天早8∶00和晚8∶00對傷口處涂藥，連續涂藥10 d。模型對照組不做處理。

1.5.2 大鼠創面愈合情況 于治療3、6、10 d后觀察各組大鼠壓瘡情況，并分別用筆描出壓瘡面積，測量，記錄[5]，應用Photoshop軟件計算創面愈合率（p）。公式：p（%）=（1-A1/A2）×100%（A1為現有傷口面積；A2為原傷口面積）。

1.5.3 蘇木素—伊紅（HE）染色觀察大鼠壓瘡皮膚組織病理變化 治療10 d后，將各組大鼠以過量水合氯醛麻醉處死，剪下背部壓瘡皮膚及周邊少許正常皮膚，置于40 g/L多聚甲醛中固定24 h；常規脫水透明、透蠟、包埋、切片、展片、貼片、烤片，后脫蠟脫水、蘇木素染色5 min、水洗2 min、伊紅液染色3 min、水洗、風干、中性樹膠封片，顯微鏡下觀察壓瘡病理改變程度。

1.5.4 免疫熒光染色法檢測大鼠創面皮膚組織中β-catenin、BMP4蛋白的表達 取石蠟切片，脫蠟水化，浸入0.01 mol/L枸櫞酸鹽緩沖液（pH須調至6.0）中抗原修復；加入體積分數10%山羊血清室溫封閉30～60 min，加入β-catenin或BMP4抗體稀釋液（1∶200）4℃孵育過夜，磷酸鹽緩沖液（PBS）沖洗；加入熒光二抗，暗盒中避光孵育60～90 min，PBS沖洗，加入DAPI染核，室溫避光染10 min，沖洗；用抗淬滅封片劑封片后，放入錫紙包好的濕盒內，倒置熒光顯微鏡下觀察并拍照。

1.6 體外實驗

1.6.1 HFSCs的分離培養 參照本課題組前期建立的HFSCs的分離培養方法[3]：將SD乳鼠以體積分數75%酒精充分消毒，無菌條件下用眼科剪剪下觸須部的全層皮膚，分離觸須毛囊，用PBS（含1%雙抗）清洗至無血色；加入0.1%的Ⅰ型膠原酶的培養皿中（體積大約為組織的3倍），置于37℃、體積分數為5%CO2的培養箱內消化20～30 min；吸出Ⅰ型膠原酶，PBS清洗，加入2.5 g/L胰蛋白酶，置于37℃、體積分數為5%CO2的培養箱內消化20～30 min；DMEM培養基（含體積分數10%FBS）終止消化，100目細胞篩過濾，1 500 r/min離心10 min，棄上清；K-SFM培養基懸浮細胞，以5×104個/mL密度接種于細胞培養皿中，常規培養傳代。

1.6.2 HFSCs免疫熒光鑒定 將圓玻片置于24孔板中消毒，將HFSCs種植在玻片上，制作細胞爬片。常規培養4～5 d，棄培養基，PBS漂洗5 min×3次，40 g/L多聚甲醛固定15～30 min；PBS清洗5 min×3次，0.5%Triton×100打孔15 min；PBS清洗5 min×3次，正常山羊血清封閉30 min；棄封閉液，加 CK15抗體（1∶100）4℃過夜；PBS清洗5 min×3次，加生物素化抗體（1∶100）5 min；PBS清洗 5 min × 3次，加 SABC-Cy3（1∶100），避光30 min；DAPI染核5 min。PBS清洗5 min×3次，封片劑封片。以PBS代替一抗設立陰性對照。

1.6.3 CCK-8法檢測HFSCs的增殖能力 取對數生長期的HFSCs按5×103個/孔接種于96孔板中，37℃、體積分數為5%CO2的培養箱中培養24 h；待細胞完全貼壁后，設空白對照組（K-SFM培養基）、陽性對照組（予bFGF干預，質量濃度分別為5、15、30、50 ng·mL-1）、CPTE組（予CPTE干預，質量濃度分別為3、10、30、50、100 μg·mL-1），更換培養基，每組設置5個復孔；分別于加藥后24、36、48、72 h加入10 μL CCK-8，繼續培養2.5 h，應用酶標儀于450 nm波長處檢測吸光度值，測定細胞活性。

1.6.4 Western blot法檢測 HFSCs中 β-catenin、BMP4蛋白的表達 HFSCs以5×104個/mL密度接種于6孔板中，設置空白對照組（K-SFM培養基），陽性對照組（bFGF 5、15 ng·mL-1），CPTE 組（CPTE 3、10、30 μg·mL-1）；各培養30 min后于冰上裂解細胞，提取細胞總蛋白。配制十二烷基硫酸鈉—聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）膠，電泳，轉PVDF膜；TBST洗5 min×3次，50 g/L脫脂牛奶浸泡1 h，TBST漂洗1次，加入用體積分數5%BSA稀釋的β-catenin或BMP4抗體（稀釋比為1∶1 000）于4℃冰箱過夜。次日取出，TBST清洗5 min×3次，加入50 g/L脫脂牛奶稀釋的HRP標記的相應二抗（稀釋比為1∶2 000），室溫孵育1.5 h。TBST洗膜5 min×3次，加ECL試劑顯色，顯影、拍照。

1.7 統計方法 應用SPSS 19.0統計軟件進行數據分析。計量資料均以均數±標準差(-x±s)表示。所有數據進行正態性及方差齊性分析，多組間比較采用單因素方差分析，LSD法進行兩兩比較。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠壓瘡皮膚愈合情況 肉眼觀察可見，治療前3 d各組大鼠均出現傷勢加重的情況，壓瘡面積均比制模成功初始的壓瘡面積大，出現負值，可能與創面炎癥反應有關[6]。持續3 d，傷勢開始好轉。治療10 d后，CPTE低、高劑量組大鼠創面已經全部結痂，邊緣平整，部分痂皮出現脫落現象，而模型對照組和溶劑對照組大鼠創面仍然有嚴重瘀血，且邊緣粗糙，見圖1。

圖1 治療10 d后各組大鼠壓瘡皮膚愈合情況Figure 1 Comparison of the healing features of pressure ulcers in various groups after treatment for 10 days

2.2 各組大鼠壓瘡創面愈合率比較 表1結果顯示：與模型對照組比較，治療3、6、10 d后，CPTE低、高劑量組大鼠瘡面愈合率明顯升高（P＜0.05或P＜0.01），且CPTE高劑量組愈合率均高于CPTE低劑量組（P＜0.05）。

2.3 各組大鼠壓瘡皮膚組織病理變化 圖2結果顯示：治療10 d后，模型對照組大鼠皮膚結痂尚不完全，皮膚結構不清，炎性細胞浸潤明顯；溶劑對照組及CPTE低、高劑量組已經結痂，表皮增厚，炎性細胞浸潤較輕，尤其以CPTE高劑量組改善最為明顯，且CPTE低、高劑量組開始出現痂皮松弛及脫落現象。

表1 各組大鼠壓瘡皮膚愈合率比較Table 1 Comparison of the healing rate for pressure ulcers in various groups (-x±s)

圖2 各組大鼠壓瘡皮膚組織病理學改變（HE染色，×100）Figure 2 Comparison of the pathological features of skin tissues in pressure ulcers in various groups（by hematoxylin and eosin staining，×100）

2.4 CPTE對大鼠創面皮膚組織中β-catenin、BMP4蛋白表達的影響 圖3結果顯示：CPTE低、高劑量組大鼠創面皮膚組織中β-catenin表達較模型對照組和溶劑對照組增強，以CPTE高劑量組表達最明顯；β-catenin主要表達于毛囊外根鞘隆突部Bulge區附近及其上部。CPTE低、高劑量組BMP4的表達較模型對照組和溶劑對照組則明顯減弱。

2.5 HFSCs形態及鑒定結果 倒置顯微鏡下可見，培養4～5 d的原代HFSCs貼壁生長，細胞形態較小，呈典型的鋪路石樣，見圖4。SABC-Cy3免疫熒光檢測結果顯示，HFSCs呈CK15陽性表達，見圖5。

圖3 各組大鼠創面皮膚中β-catenin、BMP4蛋白的表達（免疫熒光DAPI染色，×200）Figure 3 Comparison of the expression of β-catenin and BMP4 proteins in skin tissues of pressure ulcers[by immunofluorescence（DAPI staining），×200]

圖4 顯微鏡下HFSCs形態（×200）Figure 4 Morphology of HFSCs under microscope（×200）

圖5 免疫熒光鑒定P1代HFSCs中CK15的表達（×400）Figure 5 The expression of CK15 in HFSCs at passage 1 detected by immunofluorescence method（×400）

2.6 不同時間不同濃度CPTE對HFSCs增殖能力的影響 圖6結果顯示：不同濃度的CPTE分別作用HFSCs 24、36、48、72 h后，3、10、30 μg·mL-1的CPTE促HFSCs增殖，50、100 μg·mL-1的CPTE則抑制HFSCs增殖。干預72 h后，50、100 μg·mL-1的 CPTE 毒性明顯。5、15、30、50 ng·mL-1的bFGF對HFSCs增殖均有明顯的促進作用，且隨質量濃度增高，作用增強。本研究篩選出CPTE 3、10、30 μg·mL-13個濃度用于后續實驗；為了對比促增殖作用，篩選出5、15 ng·mL-1的bFGF用于后續對照研究。

圖6 不同時間不同濃度PTE對HFSCs增殖能力的影響Figure 6 The effects of different concentrations of PTE on proliferation of HFSCs at different time points

圖7 CPTE對HFSCs中β-catenin蛋白表達的影響Figure 7 The effect of CPTE on the expression of β-catenin protein of HFSCs

2.7 CPTE對HFSCs中β-catenin、BMP4蛋白表達的影響 圖7、8結果顯示：與空白對照組比較，CPTE 3、10 μg·mL-1組HFSCs中β-catenin蛋白表達水平上升（P＜0.01或P＜0.001），BMP4蛋白表達水平下降（P＜0.05）；與空白對照組比較，CPTE 30 μg·mL-1組HFSCs中β-catenin表達水平下降（P＜0.001），BMP4表達水平呈上升趨勢，但差異無統計學意義（P＞0.05）。與空白對照組比較，bFGF 15 ng·mL-1組HFSCs中β-catenin表達水平降低（P ＜0.001），bFGF 5、15 ng·mL-1組細胞BMP4表達水平均降低（P ＜ 0.001）。bFGF 5、15 ng·mL-1組中BMP4的降低效果較CPTE 3、10 μg·mL-1組明顯。

3 討論

壓瘡又名褥瘡，是長期臥床患者最常見的并發癥之一[7]，但壓瘡的預防和治療仍然是醫療和護理的難題。建立簡便穩定的動物壓瘡模型對于研究壓瘡的發生發展和轉歸具有重要的意義。本研究首次嘗試以4片磁鐵外置方法壓迫SD大鼠背部皮膚，壓迫12 h間歇12 h，2個循環，建立了SD大鼠早期壓瘡模型，結果證實該方法無創、簡便、穩定、可重復性強，可為壓瘡造模提供新的參考。

圖8CPTE對HFSCs中BMP4蛋白表達的影響Figure 8 The effect of CPTE on the expression of BMP4 protein of HFSCs

壓瘡的發生機制尚不明確，近年來有學者從干細胞角度探討皮膚損傷機制。研究發現，HFSCs是皮膚損傷修復中最重要的干細胞來源[2]。HFSCs是一種成體干細胞，具有慢周期、自我更新及多向分化的特性[8]。在正常的生理情況下，HFSCs參與毛囊與毛發的再生，當皮膚受損時，HFSCs呈線性方式向傷口中心遷移并增殖分化為上皮細胞、毛囊、皮脂腺等[2]，從而加快創面愈合。已知Wnt/β-catenin信號通路可促進HFSCs增殖參與皮膚的再生及損傷[9]。本課題組前期已經證實，CPTE可以通過激活Wnt/β-catenin信號通路促進HFSCs增殖，進而修復大鼠觸須部急性皮膚損傷[3]。

本研究將CPTE作用于大鼠早期壓瘡模型。免疫熒光結果顯示，CPTE組壓瘡部位皮膚組織的β-catenin表達增強；HE染色結果顯示，與對照組比較，CPTE組新生表皮增厚明顯，表皮與真皮連接牢固，炎性細胞浸潤較輕，且較早出現痂皮脫落現象，表明CPTE可以明顯促進壓瘡皮膚修復。進一步的體外CCK-8檢測結果顯示，CPTE 3、10 mg·mL-1具有較強的促HFSCs增殖作用，Western blot檢測結果也表明，CPTE可以增強HFSCs中的β-catenin蛋白的表達。已知β-catenin是激活Wnt/β-catenin信號通路的關鍵因子，因此推測CPTE可能通過激活Wnt/β-catenin信號通路促進HFSCs增殖進而修復大鼠壓瘡皮膚[3]。

但不受控制的增殖是危險的，Wnt信號也在黑色素瘤等皮膚惡性腫瘤中高表達，連續激活的Wnt信號可能導致毛囊腫瘤[10]。研究證實，骨形態發生蛋白（bone morphogenetic protein，BMP）信號可誘導HFSCs的分化或使其處于靜止期。Wnt與BMP信號之間存在著“交叉串擾”（crosstalk）[11]，2條信號通路相互制衡調節HFSCs毛囊周期和表皮再生[12]。當皮膚受損時，Wnt表達上調，BMP信號受抑制，HFSCs由靜息向激活態轉變，β-catinen高表達，通過核轉錄啟動靶基因表達，促進HFSCs增殖。當皮膚處于穩態時，BMP信號上調，Wnt信號下調，誘導HFSCs處于靜息狀態。經典Wnt信號通路的激活作用對于BMP信號的BMP4存在反饋調節環路[13]。本研究中動物實驗的免疫熒光鑒定及細胞實驗的Western blot檢測結果均顯示，CPTE組BMP4表達下調明顯，提示BMP信號通路可能受到抑制，與上述文獻研究結果一致。

有研究報道，bFGF促進β-catenin蛋白的表達呈劑量依賴性，有可能導致Wnt/β-catinen信號通路的過表達，引起皮膚囊腫[10]。但在本實驗中，隨劑量的增加，bFGF下調β-catenin蛋白的表達，與以往研究結果不一致，是否與濃度有關，尚待進一步研究。

綜上所述，CPTE可能通過調控Wnt/β-catenin和BMP信號通路促進HFSCs增殖進而修復壓瘡，但Wnt/β-catenin與BMP4信號通路受多種因子的調控，CPTE是否靶向調控HFSCs而促進增殖，還是可引起多種細胞的綜合效應，還有待進一步深入研究，下一步擬將體外培養的HFSCs移植于壓瘡處進行探討。