不同栽培品種高良姜HPLC 指紋圖譜研究及指標成分含量測定

龍琴，林鼎光，胡佳莉，李鐘，王淑美

[1.廣東藥科大學，廣東廣州 510006；2. 廣東省（高校）中藥質量工程技術研究中心，廣東廣州 510006；3.國家中醫藥管理局中藥數字化質量評價技術重點研究室，廣東廣州 510006]

高良姜為姜科山姜屬植物高良姜（Alpinia officinarum Hance）的干燥根莖，始載于《名醫別錄》，其性熱味辛，具有溫胃散寒、消食止痛的功效[1]。高良姜是著名的“十大廣藥”之一，也是很多中成藥如驅風油、清涼油、萬金油、良附丸、胃炎康膠囊等的主要原料，同時高良姜作為調味料，已被廣泛用于風味食品和烹調食品中[2]，在歐洲自中世紀以來就有使用高良姜的記載[3]。

高良姜主要分布于廣東、廣西、云南、海南等地，現多以人工栽培為主，以廣東湛江徐聞縣種植面積最大，故徐聞縣有“高良姜之鄉”之稱[4]，是高良姜的道地產區。高良姜主要有蜂窩姜、牛姜、雞姜和竹頭姜等幾個栽培品種[5]，其中蜂窩姜為主流品種。早期有研究者報道了蜂窩姜和牛姜在植物形態、藥材特征、內部組織構造及揮發油成分上的差異，均認為在育種時應加以區別[6，7]。但對于高良姜的另一個栽培品種竹頭姜的報道卻很少，其干燥根莖外形與蜂窩姜相似，不易鑒別，但二者化學成分是否也相似有待進一步探討。故本研究擬采用高效液相色譜（HPLC）技術，從指紋圖譜特征和指標成分含量兩方面對高良姜的不同栽培品種——蜂窩姜與竹頭姜的成分進行比較，從而為高良姜的品種鑒定、質量控制及優良種質的選擇提供參考。現將研究結果報道如下。

1 材料

1.1 儀器 島津LC-20AT高效液相色譜儀、SPD-M20A二極管陣列檢測器（日本島津公司）；DFY-400型中藥粉碎機（溫嶺市林大機械有限公司）；超聲波清洗機（寧波新芝生物科技股份有限公司）；SQP電子天平（十萬分之一，北京賽多利斯科學儀器有限公司）；FA2204B電子天平（萬分之一，上海精密科學儀器有限公司）。

1.2 試劑 二苯基庚烷A對照品（中國藥品生物制品檢定所，批號：111757-200601，純度≥98%）；高良姜素對照品（上海源葉生物科技有限公司，批號：B20430，純度≥98%）；山柰素對照品（北京索萊寶科技有限公司，批號：519B021，純度≥98%）。乙腈（瑞典歐普森公司，色譜純），甲醇（天津市致遠化學試劑有限公司，分析純）；磷酸（天津市大茂化學試劑廠，分析純）；純凈水（廣州屈臣氏有限公司）。

1.3 試藥 蜂窩姜、竹頭姜2個栽培品種均采集于廣東徐聞縣南山鎮，經廣東藥科大學中藥學院李鐘副教授鑒定，確認其均為姜科山姜屬植物高良姜Alpinia officinarum Hance的干燥根莖，樣品具體信息見表1。

表1 高良姜樣品信息Table 1 The information of Alpinia officinarum Hance samples

2 方法與結果

2.1 溶液的制備

2.1.1 混合對照品溶液制備 取二苯基庚烷A、高良姜素、山柰素對照品適量，精密稱定，加甲醇制成含二苯基庚烷A 0.205 mg/mL、高良姜素0.207 mg/mL、山柰素0.050 mg/mL的混合對照品溶液，搖勻，即得。

2.1.2 供試品溶液制備 取高良姜粉末（過65目）0.2 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇20 mL，稱定質量；室溫超聲提取45 min（250 W，40 kHz），放至室溫；再稱定質量，加甲醇補足減失質量，搖勻，用0.22 μm微孔濾膜濾過，即得。

2.2色譜條件色譜柱：迪馬Diamonsil C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）。流動相：0.2%磷酸水溶液（A）—乙腈（B），梯度洗脫（0～10 min，37% ～43%B；10～30 min，43%B；30～40 min，43% ～65%B；40～55 min，65% ～85%B；55～60 min，85%～100%B）；流速1.0 mL/min；柱溫30℃；檢測波長210 nm；進樣量10 μL。

2.3 不同栽培品種高良姜HPLC指紋圖譜研究

2.3.1 精密度試驗 取同一批高良姜樣品（S11），按照“2.1.2”項下方法制備供試品溶液，按照“2.2”項下色譜條件測定，連續進樣6次，記錄指紋圖譜。高良姜素（6號峰）在藥材中的相對含量較高，保留時間居中，分離度好，故以高良姜素（6號峰）為參照峰，分別計算出各共有峰的相對保留時間和相對峰面積的相對標準偏差（sR）。結果各共有峰相對保留時間sR≥1.3%，相對峰面積sR≥1.1%，表明儀器精密度良好。

2.3.2 穩定性試驗 取同一批高良姜樣品（S11），按照“2.1.2”項下方法制備供試品溶液，按照“2.2”項下色譜條件，分別在 0、4、8、12、18、24 h進樣測定，記錄指紋圖譜，以高良姜素（6號峰）為參照峰，分別計算出各共有峰的相對保留時間和相對峰面積的sR，結果各共有峰相對保留時間sR≥2.3%，相對峰面積sR≥1.9%，表明供試品溶液在24 h穩定。

2.3.3 重復性試驗 取同一批高良姜樣品（S11）6份，按照“2.1.2”項下方法制備供試品溶液，按照“2.2”項下色譜條件測定，記錄指紋圖譜，以高良姜素（6號峰）為參照峰，分別計算出各共有峰的相對保留時間和相對峰面積的sR，結果各共有峰相對保留時間sR≥1.8%，相對峰面積sR≥1.6%，表明該方法重復性良好。

2.3.4 不同栽培品種高良姜HPLC指紋圖譜比較取11批高良姜藥材，分別按照“2.1.2”項下方法制備供試品溶液，按照“2.2”項下色譜條件進樣，記錄色譜圖。將色譜圖數據導入“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統（2012版）”軟件，得到11批高良姜色譜疊加圖（見圖1）以及竹頭姜與蜂窩姜的對照指紋圖譜（見圖2）。圖1、2結果顯示，不同栽培品種高良姜共有峰12個，可辨別出二苯基庚烷A、高良姜素、山柰素。竹頭姜與蜂窩姜各峰面積存在差異，其中峰1、6（高良姜素）、11、12的峰面積差異相對明顯，竹頭姜峰1的峰面積明顯高于蜂窩姜，而峰6（高良姜素）、11、12的峰面積明顯低于蜂窩姜，故從整體上看竹頭姜峰面積較蜂窩姜低。此外，不同栽培品種高良姜有各自的特有峰，如圖2的箭頭標注處即為各栽培品種的特有峰。

2.3.5 不同栽培品種高良姜指紋圖譜相似度分析 采用“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統（2012版）”軟件對11批高良姜樣品的指紋圖譜進行相似度分析，設定樣品S11為參照圖譜，“時間窗寬度”為0.1 min，中位數法計算，選定12個特征峰進行多點校正，以Mark峰匹配，計算各樣品間的相似度，結果見表2。樣品S1～S5（均為竹頭姜）之間的相似度為0.996～1.000，樣品S6～S11（均為蜂窩姜）之間的相似度為0.981～1.000，而竹頭姜與蜂窩姜之間的相似度為0.760～0.860，即竹頭姜與蜂窩姜之間相似度明顯低于同品種高良姜之間的相似度。可見竹頭姜與蜂窩姜之間的化學成分存在較大差異，通過相似度分析可量化不同栽培品種高良姜之間化學成分的總體差異。

圖1 11批高良姜HPLC指紋圖譜Figure 1 HPLC fingerprints of 11 batches of Alpinia officinarum Hance samples

圖2 竹頭姜（A）、蜂窩姜（B）的對照指紋圖譜及混合對照品（C）的HPLC色譜圖Figure 2Reference fingerprints of Zhutou galangal（A）and Fengwo galangal（B）and HPLC chromatogram of mixed reference substance（C）

2.3.6 不同栽培品種高良姜聚類分析 將11批高良姜HPLC圖譜12個共有峰的峰面積導入Unscrambler Software 10.4軟件中，選用分層單鏈接（hierarchical single-linkage）法，以歐氏距離（Euclidean distance）為測度進行聚類分析，結果見圖3。當判別條件距離等于7時，11批高良姜樣品可分成了兩大類，第1類為樣品S1～S5（均為竹頭姜），第2類為樣品S6～S11（均為蜂窩姜），該結果與相似度分析結果相一致。從栽培年限上分析，在相同品種的下分類中，4、5年生的樣品交叉分布，由此得出，高良姜化學成分相對含量與種植年限的相關性不顯著，即高良姜種植4年后，增加種植年限對化學成分的變化無很大影響，故在產地高良姜多只栽培3～4年[2]具有一定的合理性。

表2 11批高良姜HPLC指紋圖譜相似度結果Table 2 HPLC fingerprint similarities of 11 batches of Alpinia officinarum Hance

圖3 11批高良姜HPLC指紋圖譜聚類分析Figure 3 Cluster analysis of 11 batches of Alpinia officinarum Hance

2.3.7 不同栽培品種高良姜主成分分析（PCA）將11批高良姜HPLC圖譜12個共有峰的峰面積導入Unscrambler Software 10.4軟件中進行PCA，結果見圖4、5。第一主成分（PC-1）和第二主成分（PC-2）的累積貢獻量為97%，表明其基本上保留了原始數據中所有信息量。從圖4的主成分得分圖看出竹頭姜與蜂窩姜在第一主成分方向得到很好的區分（竹頭姜主要分布在PC-1的正軸方向，蜂窩姜主要分布在PC-1的負軸分向）。為了解各個共有化學成分對區分竹頭姜與蜂窩姜的貢獻，進行了載荷分析，結果見圖5，距離（0，0）點越遠的變量，貢獻程度越高，表明該特征峰對樣本分類的解釋能力越強。代表峰3、6（高良姜素）、11、12的點離（0，0）點較遠，結合主成分得分圖知，竹頭姜與蜂窩姜主要是在第一主成分方向得以分開，而峰6（高良姜素）、11、12在PC-1方向的投影相對大些，即第一主成分主要解釋了峰6、11、12的信息，故峰6（高良姜素）、11、12是鑒別竹頭姜與蜂窩姜的關鍵化學成分，該結果與“2.3.4”項下的分析結果（峰6、11、12的峰面積差異較明顯）相一致。

圖4 11批高良姜主成分得分圖Figure 4 Principal component scores plot of 11 batches of Alpinia officinarum Hance

圖5 12個共有峰因子載荷圖Figure 5 Factor loading plot of 12 common peaks

2.4 不同栽培品種高良姜指標性成分含量測定

2.4.1 線性關系考察 精密吸取“2.1.1”項下的混合對照品溶液適量，制成6個不同質量濃度的溶液，按“2.2”項下色譜條件測定，以對照品質量濃度[ρ/（mg·L-1）]為橫坐標（X），峰面積（A）積分值為縱坐標（Y），繪制標準曲線并進行回歸計算。3個成分的線性回歸方程見表3，表明二苯基庚烷A、高良姜素、山柰素在相應濃度范圍內，與峰面積具有良好的線性關系。

表3 3個成分的線性回歸方程、相關系數和線性范圍Table 3 Linear regression equations，correlation coefficient and linear range for 3 index compounds

2.4.2 精密度試驗 取同一批高良姜樣品（S11），按照“2.1.2”項下方法制備供試品溶液，按照“2.2”項下色譜條件測定，連續進樣6次，記錄二苯基庚烷A、高良姜素、山柰素的峰面積。計算各峰面積的sR，分別為0.33%、0.29%、0.35%，表明儀器精密度良好。

2.4.3 穩定性試驗 取同一批高良姜樣品（S11），按照“2.1.2”項下方法制備供試品溶液，按照“2.2”項下色譜條件，分別在 0、4、8、12、18、24 h進樣測定，記錄二苯基庚烷A、高良姜素、山柰素的峰面積。計算各峰面積sR，分別為1.57%、1.85%、1.75%，表明供試品溶液在24 h穩定。

2.4.4 重復性試驗 取同一批高良姜樣品（S11）6份，按照“2.1.2”項下方法制備供試品溶液，按照“2.2”項下色譜條件測定，記錄二苯基庚烷A、高良姜素、山柰素的峰面積。計算各峰面積sR，分別為1.26%、1.23%、1.33%，表明該方法重復性良好。

2.4.5 加樣回收試驗 取已知含量的同一批高良姜樣品（S11）6份，每份約0.1 g，精密稱定，均精密加入二苯基庚烷A（質量濃度為504 mg·L-1）、高良姜素（質量濃度為484 mg·L-1）、山柰素（質量濃度為110 mg·L-1）各2 mL，按照“2.1.2”項下方法制備供試品溶液，按照“2.2”項下色譜條件測定，分別計算二苯基庚烷A、高良姜素、山柰素的回收率。結果見表4，表明該方法加樣回收試驗結果良好。

2.4.6 樣品含量測定 分別取11批高良姜藥材粉末，按照“2.1.2”項下方法制備供試品溶液，按照“2.2”項下色譜條件測定，每批平行測2次。11批高良姜藥材二苯基庚烷A、高良姜素、山柰素含量測定結果見表5。竹頭姜與蜂窩姜二苯基庚烷A的平均含量分別為1.13%、1.08%；高良姜素的平均含量分別為0.30%、0.98%；山柰素的平均含量分別為0.18%、0.21%。經統計學檢驗，竹頭姜與蜂窩姜中高良姜素含量存在顯著性差異。從不同栽培年限上看，同品種高良姜中二苯基庚烷A、高良姜素、山柰素的含量均變化不大，說明高良姜種植4年后，再增加種植年限對這些成分含量的增長并沒有很大影響，這與聚類分析得出的結論一致。

表4 二苯基庚烷A、高良姜素、山柰素加樣回收結果Table 4 Sample recovery results of diphenylheptane A，galangin and kaempferid

表5 11批高良姜樣品含量測定結果Table 5 The results for content determination of 11 batches of Alpinia officinarum Hance samples（n=2）

3 討論

本研究通過對比竹頭姜與蜂窩姜的HPLC指紋圖譜，從圖譜上可直觀地看出二者組成成分類似，但各組分比例差異顯著。采用相似度分析、聚類分析及主成分分析進行分析，其結果相一致，均可將竹頭姜與蜂窩姜分開，進一步表明竹頭姜與蜂窩姜的化學成分存在差異。因此，利用HPLC指紋圖譜可較好地區分不同栽培品種高良姜，但還需收集足夠樣品，以期建立標準、穩定、可靠的不同栽培品種高良姜HPLC指紋圖譜，為高良姜栽培品種的鑒定、質量控制及品種選育提供技術支撐。

本研究還測定了高良姜中二苯基庚烷A、高良姜素、山柰素的含量，其中高良姜素、山柰素是其主要黃酮類成分，也是主要活性成分。目前很多研究報道高良姜素具有抗腫瘤[8，9]、抗菌[10]、抗氧化[11，12]、抗炎[13，14]等藥理活性。本研究結果顯示高良姜素含量在竹頭姜與蜂窩姜中的差異明顯，故推斷竹頭姜與蜂窩姜中高良姜素的含量差異可能會造成二者藥效的差異。此外，在現行藥典標準中，高良姜含量測定項規定高良姜素含量不低于0.7%[1]，顯然竹頭姜中高良姜素的含量不符合標準。因此還需對這兩個栽培品種高良姜進行藥效學研究，以確定療效較優品種。由于傳統經驗鑒別認為高良姜味辛辣者為佳[15]，而二苯基庚烷類成分是高良姜產生辣味的主要有效部位[16]，二苯基庚烷A又是其中的主要成分，故應重視從二苯基庚烷A的含量上控制和評價高良姜的質量。本實驗在同一色譜條件下，同時對二苯基庚烷A、高良姜素、山柰素的含量進行測定，結果表明，所建立的方法可靠，重復性好，可為高良姜質量標準提升提供參考。