太平洋牡蠣在活品流通過程中的質譜-肽組學分析

陳李品 張曉梅 胡玲萍 畢詩杰 林黎明 李兆杰 張鴻偉 薛長湖

摘?要?在實驗室模擬太平洋牡蠣保活流通過程，采用超高效液相色譜-四極桿飛行時間質譜聯用技術（UHPLC-Q-TOF）分析太平洋牡蠣在活品流通過程中內源肽的變化，利用化學計量學方法篩選出各流通階段的多肽標志物，以期篩選出一組評價太平洋牡蠣活品流通過程中品質變化的新指標。根據肽組學技術對整個活品流通階段的3個環節（清洗、暫養凈化以及無水保活）共7個關鍵時間點的樣品進行內源肽提取，使用UHPLC-Q-TOF分離鑒定，并獲得各個流通階段的肽組輪廓。通過主成分分析（PCA）和正交偏最小二乘判別分析（OPLS-DA）等多元統計分析進行數據挖掘，并篩選出潛在的多肽標志物，經過在線數據庫比對，鑒定出多肽氨基酸序列。結果表明，在清洗、暫養凈化以及無水保活階段分別篩選出3、10、8條潛在的多肽標志物。以潛在的多肽標志物DYDPVDK為例，建立可用于日常分析的基于液相色譜-三重四極桿質譜多反應監測（MRM）的分析方法。本研究采用肽組學技術對活品太平洋牡蠣在不同流通階段的內源肽進行組學表征，篩選出指征不同流通階段的潛在的多肽標志物，為活品貝類的流通過程提供檢測依據。

關鍵詞?超高效液相色譜-四極桿飛行時間質譜;?太平洋牡蠣;?肽組學;?多反應監測; 活品流通;?化學計量學

1?引 言

牡蠣屬軟體動物門，瓣鰓綱，牡蠣目，牡蠣科，是一種重要的海洋水產資源，其營養豐富，肉質鮮嫩，深受消費者的喜愛。隨著世界上貝類海產品的產品結構發生變化，國內外市場上特別是一些內陸地區對鮮活貝類需求也越來越高。因此，需要建立與優化活品牡蠣的生鮮供應鏈[1～3]，完善活品牡蠣供應鏈的前提是建立精準的、針對活品牡蠣的品質評價方法。

隨著捕撈后流通時間的延長，活品牡蠣的體內會發生一系列變化，導致品質不斷下降直至死亡。在流通過程中因缺少攝食而需要消耗自身能量物質維持生命活動，造成脂肪、蛋白、糖原等能量物質的下降，以及活力水平（超氧化物歧化酶、ATP等）、風味及營養品質下降。牡蠣活品在流通過程中面臨多種環境脅迫，包括饑餓、干露和溫度脅迫等，造成流通過程中其品質變化的復雜性。目前，對活品牡蠣在流通過程中的品質評價主要依靠傳統的風味指標、能量代謝產物以及生命特征等[1，3]，尚未有國家標準，難以全面反映牡蠣的整體品質[4]。因此，需要不斷完善品質評價體系。

隨著檢測技術與分析技術的進步，尤其是高分辨質譜（High resolution mass spectrometry，HRMS）[5]技術的成熟和相關數據處理軟件的升級，組學技術已成為品質評價的重要技術[6～9]。近年提出的食品組學技術[10]?，不僅可以解決食品基質復雜的難題[11]，更能從整體生物學角度分析品質[9]。肽組學是一個來源于蛋白質組學的新興領域[12]，研究生物樣本中的所有內源性多肽，可縮小蛋白組與代謝組的差距[13]?。肽組學與蛋白質組學的技術方法體系有許多相似之處，但在分析內容如研究對象、解析深度等方面也存在顯著差異。總體而言，在以質譜技術為基礎的組學分析中，肽的分析難度小于完整蛋白，因此，肽作為分析目標與蛋白相比更具吸引力。目前，蛋白組被廣泛應用于水產品品質變化的檢測，如Bosworth等[14]對受低氧脅迫的斑馬魚的魚肉進行研究分析，發現低氧對6種低豐度蛋白產生影響，而不影響蛋白的表達模式，而肽組學技術則多被應用于食源性活性肽結構的鑒定，如Wu等[15]利用肽組學中的LC-MS/MS并輔以定量構效關系對大豆蛋白源ACE抑制肽進行了純化和表征，闡明5條三肽序列分別為IVF、LLF、LNF、LSW和 LEF; 肽組學也被用于人類疾病標志物的篩查[12，16]。但在活品牡蠣流通過程中內源肽是否發生變化以及結構鑒定方面尚未見報道。

本研究采用超高效液相色譜-四極桿飛行時間質譜（UHPLC-Q-TOF）技術，結合化學計量學方法，分析篩選出各流通階段活品太平洋牡蠣潛在的多肽標志物，并建立了可用于日常分析的基于液相色譜-三重四極桿質譜多反應監測（MRM）的分析方法。本研究利用肽組學技術闡明太平洋牡蠣在流通階段內源肽的變化規律，并篩選出太平洋牡蠣在活品流通過程中與品質變化有關的多肽標志物，以期建立一組分子水平上的評價指標，完善活品牡蠣的品質評價體系。

2?實驗部分

2.1?儀器與試劑

Nexera X2 30A高效液相色譜儀（日本島津公司）; 1290高效液相色譜（美國Agilent 公司）; AB SCIEX Triple TOF 5600質譜儀、Triple QuadTM 5500三重四極桿質譜儀（美國SCIEX 公司）; MQS50001型超純水系統（美國Millipore公司）。

甲酸（質譜級）、二硫蘇糖醇（DTT）、碘乙酰胺（IAA） （美國Sigma公司）; 乙腈（美國Fisher公司）; 其它試劑均為分析純。

2.2?實驗方法

2.2.1?樣品的采集?活品太平洋牡蠣選用山東乳山（36°49′38.66′′ N，121°42′3.84′′E）的2 齡貝[殼高（108.32± 2.5 ）mm，體質量（76.23±3.5）g]，確保每組實驗樣品大小均一，采捕于2018年4月。太平洋牡蠣捕撈到岸后，加冰運至實驗室，立刻取出30只牡蠣作為起始點（編號為a組），并對牡蠣進行常規清洗，再次取樣（編號為b組）。清洗后，對太平洋牡蠣進行暫養凈化處理24 h，進行真空包裝，于4℃進行保活實驗（1～9 d），于第1、3、5、7和9 d進行取樣。

2.2.2?多肽樣品制備?按上述采樣時間準時采樣，隨機采取30只牡蠣，迅速取可食部位并用液氮速凍后研磨。取20 g研磨后的粉末，95℃加熱滅酶10 min，在4℃以15000 r/min離心15 min，收集上清液，得肽粗提液。

取上清液，分別加入1 mol/L DTT100 μL，60℃水浴振搖反應30 min，然后冷卻至室溫，再加入1 mol/L現配的IAA溶液750 μL，室溫避光反應1 h。將上述溶液使用ODS-C18固相萃取小柱（1 mg/6 mL）[17]除鹽，凍干。凍干樣品用200 μL 0.1% 甲酸-水復溶，轉移到超濾離心管（10 kDa，Millipore公司）中，在室溫以8000 r/min 超濾離心20 min，收集肽段濾液。

2.2.3?儀器數據采集的質量控制（Quality control，QC）

在本實驗中，共進樣45個（樣品），包括生物學重復與技術重復。為更好地表征所有樣液的質譜特征，質控樣品采用合并樣液的方式制備，將7個取樣點的太平洋牡蠣樣本的多肽提取液各取200 μL，充分混勻后作為質控樣品（QC sample）。在DDA分析模式的采集中，質控樣品的進樣順序和進樣頻率安排如下： （1）在進樣序列分析前，QC 樣品連續進樣5次以平衡整個液相色譜-質譜分析體系; （2）在進樣序列中，大約每隔15個樣品，進樣一針 QC 樣品，共計8次穿插進樣，以覆蓋整個序列，保證對整個分析時長進行測定穩定性評估; （3）形成“QC（連續5次）-試樣（1～15）-QC6-試樣（16～30）-?QC7-試樣（31～45）-QC8”的分析序列[18]。同時，在整個實驗中，以每5個樣品校準一次的頻率進行質量軸校準。

2.2.4?UHPLC-Q/TOF數據依賴性采集（DDA）?采用本研究組已優化的方法進行檢測[17]。 采用超高效液相色譜-四極桿飛行時間質譜（UHPLC-Q-TOF）對提取出的多肽濾液進行分析鑒定。使用安捷倫AdvanceBio Peptide Map column（150 mm×2.1 mm，13 nm，2.7 μm）色譜柱; 柱溫： 40℃。流動相A為0.1%甲酸-水，B為0.1%甲酸-乙腈。梯度洗脫： 0～2 min，5% A; 2～27 min，5%～0% A; 27～37 min，20%～35% A; 37～39 min，35%～80% A; 39～42 min，80% A; 42～46 min，5% A。流速： 0.25 mL/min;?質譜分析采用AB SCIEX TripleTOF 5600檢測，TOF掃描范圍： 350～1500Da，電噴霧正離子（ESI+）模式; 噴霧電壓： 5500 V; 霧化氣壓力： 60 psi （1 psi=6.895 kPa）; 輔助加熱氣壓力： 50 psi; 氣簾氣壓力： 35 psi; 離子源溫度： 525℃; 解簇電壓： 100 V。

2.2.5?潛在的多肽標志物的篩選?原始數據導入MarkerView（1.2.1，AB Sciex）進行峰的提取，并使用該軟件利用總峰面積對數據進行歸一化校正。歸一化后的數據使用SIMCA-P（14.0，Umetrics）進行相關化學計量學分析，以篩選潛在的多肽標志物，主要包括主成分分析（PCA）和正交偏最小二乘判別分析（OPLS-DA），即分別進行無監督與有監督分類。

將每個樣品3次平行采集的DDA數據使用Protein Pilot（5.0.2，AB Sciex）軟件進行多肽的鑒定，檢索NCBI（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov）太平洋牡蠣（Crassostrea gigas）的蛋白數據庫（75135蛋白質序列，2018年11月下載）。主要鑒定參數設置如下： 半胱氨酸（Cys）烷基化試劑： Iodoacetic acid; 水解酶： None; 允許生物學修飾和氨基酸替代; 搜索設置： Thorough ID; 可信閾值： Unused Protscore（Conf）>1.3（95%）; 假陽性錯誤率（False Discovery Rate，FDR）： <1%。

2.2.6?質譜多反應監測（MRM）確認篩選出的潛在的多肽標志物?采用液相色譜串聯Triple QuadTM 5500三重四極桿質譜儀建立多反應監測（MRM）方法[19，20]。液相色譜柱為AdvanceBio Peptide Map column（150 mm×2.1 mm，13 nm，2.7 μm）; 柱溫： 40℃。流動相A為0.1%甲酸-水，流動相B為0.1%甲酸-乙腈; 流速： 0.35 mL/min。梯度洗脫： 0～0.5 min，5% A; 0.5～17.0 min，5%～5% A; 17.0～17.5 min，35%～95% A; 17.5～20.0 min，95% A; 20.0～20.1 min，95%～5% A; 20.1～25.0 min，5% A。

電噴霧正離子（ESI+）模式; 噴霧電壓： 5500 V; 霧化氣壓力： 60 psi; 輔助加熱氣壓力： 50 psi; 氣簾氣壓力： 35 psi; 離子源溫度： 575℃。

使用 Skyline 工具構建潛在的多肽標志物的MRM離子對，采用 Analyst 軟件（Version 1.6.2，SCIEX）進行數據分析[21]。

3?結果與討論

3.1?數據分析前處理

由活品太平洋牡蠣各流通時期的總離子流色譜圖（圖1A）可見，峰形較好，可用于肽的組學分析，不同流通階段的總離子流圖高度相似，說明不同品質的牡蠣內源肽比較相似，在活品流通期間內源性多肽僅有輕微的變化。在這種情況下，需通過化學計量學方法分析不同流通時間肽組的變化，進行品質區分。此外，從8個QC樣本的總離子流色譜圖（圖1B）可見，QC樣本表現出良好的譜圖重復性，說明在實驗期間儀器狀態穩定，實驗結果可信度高[22]。

3.2?數據統計分析

3.2.1?基于不同流通階段的肽組輪廓分析?PCA分析屬于無監督的化學計量學分析方法，通過主成分的提取實現數據降維。圖2A為流通過程中各實驗組的PCA分析得分圖（Score plots），其中橢圓性區域為在95%置信限水平霍特林T2檢驗的可信區域，所有樣品均位于霍特林T2的置信橢圓內。不同流通階段的內源肽有一定差異，可進一步篩選流通過程中變化較大的多肽標志物。

為更深層次地分析不同品質內源多肽物的差異，克服無監督方法PCA分析在變量差異尋找方面的局限性，本實驗采用有監督的OPLS-DA進一步進行數據信息的挖掘[23]。圖2B給出流通過程中各實驗組的OPLS-DA模型得分圖。由圖2B可見，不同流通階段的牡蠣在OPLS-DA得分圖中得到了非常清晰的區分效果，所有組的數據均緊密聚集，均位于霍特林T2的置信橢圓內。相比PCA分析，OPLS-DA模型中數據的聚集緊密度和分類清晰度均有顯著提升。在構建的OPLS-DA模型中，擬合優度（R2X（cum）、R2Y（cum））和預測能力Q2（cum）的值分別為0.945、0.985和0.934，可見構建的OPLS-DA模型具有很好的擬合優度和模型預測能力。OPLS-DA模型的穩健性評估見圖3C，在隨機進行的200次置換檢驗中，所有隨機置換模型的R2和Q2參數值均顯著低于已構建模型的相應參數值，置換回歸曲線的截距分別為R2=0.355; Q2=0.648，提示構建的模型穩健，不存在過擬和。

3.2.2?OPLS-DA兩兩比較及潛在的多肽標志物的篩選?聚類分析表明，不同流通階段肽組有差異。為了篩選對流通階段品質變化具有較大貢獻的潛在的多肽標志物，需要進一步構建兩兩比較OPLS-DA模型進行差異分析。具體流程如下： （1）使用不同流通階段的樣本兩兩比較構建OPLS-DA分析模型（分為3組： 清洗、暫養、無水保活）; （2）進行OPLS-DA模型質量評估; （3）按設定的過濾規則進行品質多肽標記物的發現。兩兩比較模型的質量評估參數見表1。所有構建的OPLS-DA模型在擬合優度（R2X（cum），R2Y（cum））、預測能力Q2（cum）、穩健度（R2，Q2的回歸曲線截距）方面均滿足要求。

為保證篩選出的多肽標志物具有統計學意義，根據多肽在OPLS-DA模型中的VIP值、變化倍數（Fold change）和p|corr|值對結果進行過濾，并通過載荷圖刀切置信區間進行檢驗（以清洗與未清洗組的篩選過程進行圖示說明，圖3）。最終篩選結果以及前體蛋白見表2。結果表明，在清洗、暫養凈化以及無水保活階段分別篩選出3、10和8條潛在的多肽標志物，前體蛋白包括超氧化物歧化酶、肌球蛋白輕鏈和激肽釋放酶等，主要涉及能量代謝、脂質氧化以及免疫水平等，說明在太平洋牡蠣的不同流通階段均涉及多種應激反應，引起內源肽的變化。

3.3?多反應監控模式下對潛在的多肽標志物的歸屬

三重四極桿質譜作為低分辨質譜的代表，相比高分辨質譜其主要優勢是靶向分析中的高靈敏度、高選擇性和高重現性，通常用于目標組分的定量分析。所以，本實驗對通過高分辨質譜篩選到的潛在的多肽標志物（以DYDPVDK為例進行說明）進行合成（南京金斯瑞公司，純度>98%）并建立可用于日常分析的基于液相色譜-三重四極桿質譜的多反應監測（MRM）分析方法。使用Skyline軟件處理MRM數據。對于每種肽，MS/MS譜中最強的3～5個峰被手動選擇為初步的MRM傳輸離子對[24]，僅選擇了b-或y-碎片離子見表3。 Skyline預測了去簇電壓和碰撞能量值。每個MRM傳輸離子對的停留時間設置為5 ms。圖4為篩選出的潛在的多肽標志物（DYDPVDK）經MRM轉換后的樣品與標品中的代表性提取離子色譜圖（XIC）。根據同一肽的MRM離子對具有相同的保留時間，以及離子比率是否位于鑒定分析的容許范圍（30%的變異范圍）內判斷肽段序列的正確性。由圖4可見，樣品中該肽段的保留時間與合成肽段保留時間基本相同，在合成的肽段中，2對MRM離子對的離子比率為0.72∶0.28（峰高比），而在太平洋牡蠣樣品中相應的2對MRM傳輸離子對離子比率則為0.73∶0.27，表明此肽段的序列鑒定結果的正確性以及MRM方法的適用性。

4?結 論

采用超高效液相色譜-四極桿飛行時間質譜（UHPLC-Q-TOF），結合化學計量學方法，分析篩選出太平洋牡蠣各流通階段的潛在的多肽標志物，并驗證篩選方法的正確性以及建立可用于日常分析使用的基于液相色譜-三重四極桿質譜的多反應監測（MRM）分析方法的可行性。本研究利用肽組學技術分析太平洋牡蠣在活品流通過程中的內源肽，以期篩選出一組新的評價指標，完善其保活流通過程中品質變化的評價體系。肽組學技術已成為生物標志物篩查的新方法，具有廣闊的發展空間。本方法為后續的太平洋活品牡蠣品質評價提供了一個新思路。

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