基于空芯光纖-衰減全反射傅里葉變換紅外光譜技術的骨關節炎不同病期的有監督識別

趙遠 朱勇康 陸燕飛 尚林偉 符娟娟 馬丹英 王瀟 尹建華

摘?要?衰減全反射傅里葉變換紅外光譜技術（ATR-FTIR）可實現微量樣本的快速可靠的在體紅外光譜檢測。本研究采用自行搭建的空芯光纖（HOF）ATR-FTIR探針技術，結合主成分分析（PCA）及Fisher判別（FDA）算法，對不同病變階段（健康，病變8周、3個月、7個月）比格犬的骨關節炎（OA）離體樣本進行原位鑒別分析。對初始樣本識別正確率為100%;各組分別選取一獨立樣本作為預測組，預測組樣本識別正確率為100%;所有交叉驗證的識別率均超過95%。本方法能客觀地準確鑒別不同病變階段的OA樣本，可作為不同OA病變階段的診斷參考。結合主觀的OA評分結果，HOF-ATR-FTIR技術在OA的在體原位臨床診斷中具有重要的應用價值，有望為OA提供更加客觀精確的光譜分級和分期結果。

關鍵詞?骨關節炎; 空芯光纖-衰減全反射傅里葉變換紅外光譜; 主成分分析; Fisher判別

1?引 言

骨關節炎（OA）是由生物因素和機械性損傷相互作用引起的一系列病理生理變化進而產生的生物力學紊亂所致[1]，在OA的治療中，最為關鍵的是對OA實現早期診斷、早期預防、早期治療。臨床上OA診斷分級的經典手段包括Kellgren和Lawrecne的放射學診斷標準[1，2]、美國風濕病學院提出的X線/臨床加X線診斷[1]等; 實驗室中常根據關節軟骨的病理損傷作為OA病變評分/分級的“金標準”，常用的有Mankin評分（HHGS評分）[1，3～5]、OARSI osteoarthritis cartilage histopathology assessment system（OOCHAS評分）[1～3，6]等。然而這些方法或不能在發病初期診斷出不易被察覺的軟骨基質的毀壞和不明顯的機械傷害，或難于對軟骨基質實現原位探測，且受主觀因素影響較大，因此發展有效的OA監測和診斷技術方法對OA的研究及臨床診療有著重要意義。

針對OA的診斷除了影像學檢查（X線檢查、CT檢查、磁共振檢查、超聲學檢查、核素掃描等[1]）、生化手段檢查（血液檢查、尿液檢查、關節滑液檢查等[1]）外，越來越多的研究采用傅里葉變換紅外（FTIR）光譜技術[7～11]。通過FTIR光譜技術，可從分子水平對樣本的變化進行研究。衰減全反射（ATR）技術則是適用于小面積、小體積測量的光學技術，且對樣品預處理沒有特殊要求[12～17]。自20世紀90年代初開始，其被引入到FTIR光譜學，特別是進一步與光纖聯用[14]，可準確、快速、靈活地應用于組織的原位紅外光譜檢測中，實現對微量樣本的在體紅外光譜檢測，具有良好的臨床診斷應用前景。

在本課題組的同期研究中，將主成分分析（PCA）、Fisher判別（FDA）引入到FTIR成像對正常和病變關節軟骨樣本的識別研究[18，19]。FDA方法是一種可借助方差分析建立判別函數并對數據集進行快速分類識別的有監督算法，本課題組高準確率地實現了對正常和病變的關節軟骨樣本的識別，證明了PCA-FDA方法應用于OA離體切片診斷的可靠性及穩定性。但FTIR成像需要對樣本進行切片后再進行光譜采集和成像，是非原位光譜測量。在近期研究中，本課題組開發出空芯光纖（HOF）ATR-FTIR聯用技術，可用于軟骨及OA的原位探測[14]。本研究將空芯光纖-衰減全反射傅里葉變換紅外光譜（HOF-ATR-FTIR）技術與PCA-FDA方法結合，在獲得不同病變階段的離體原位OA樣本的ATR紅外光譜信息后，進行快速有監督分類識別，為OA臨床前的原位定量分類和分期提供了參考。

2?實驗部分

2.1?樣本處理及關節炎評分

實驗所用樣本均由江蘇亞東實驗動物研究院提供。選擇8只健康比格犬，對其中2只的左后腿膝關節脛骨平臺進行原位提取，從而獲取健康樣本;其余6只進行單后腿（左后腿/右后腿）的膝關節前交叉韌帶橫斷手術[3]，以誘導OA病變發生。OA造模術后，6只模型犬分為3組，分別培養8周（8w-1 & 8w-2）、3個月（3m-1 & 3m-2）以及7個月（7m-1 & 7m-2）后，對其手術側的后腿膝關節脛骨平臺進行原位樣本提取，使用生理鹽水進行清洗以備用。樣本的培育和取樣遵循本單位和協作單位實驗動物倫理學委員會要求。

前文提及的OOCHAS評分標準是根據損傷深度及相應組織反應將OA分為0～6級，根據損傷范圍的大小將OA分為0～4期，其分級與分期的乘積即為最終得分[3]。OOCHAS評分標準對OA早期的分期較為精細[3]，因此本研究按照此標準對每個樣本進行評價，得到評分結果如表1所示。

2.2?光譜采集及數據分析

樣本清洗后，將目標樣本置于三維樣本臺上，采用自制的HOF-ATR探頭[16]并耦合傅里葉變換紅外光譜儀（Vertex 70，Bruker公司）對樣本進行多點原位光譜采集（點位數如表1所示），其中光譜采集和光譜處理使用光譜儀配套的OPUS 7.0軟件進行。表1中，樣本8w-1、8w-2所檢測點位中均包含半月板未覆蓋區域的1個點以及半月板覆蓋區域的4個點（其中均有1個明顯損傷點）。樣本3m-1、3m-2所檢測點位中均包含半月板未覆蓋區域的2個點以及半月板覆蓋區域的4個點。樣本7m-1（7m-2）所檢測點位中包含半月板未覆蓋區域的3（2）個點以及包含半月板覆蓋區域的3（3）個點，其中樣本7m-1對半月板未覆蓋區域磨損嚴重位置補充檢測1個點。樣本Healthy-1、Healthy-2所檢測點位中均包含半月板未覆蓋區域的4個點以及半月板覆蓋區域的5個點。光譜采集范圍為4000～ 900 cm1，間隔4 cm1。

對所檢測的光譜數據使用OPUS 7.0軟件進行基線校正后，先采用IBM SPSS Statistics 22軟件對光譜數據進行PCA，再選擇適當的主成分因子進行有監督FDA。FDA處理過程中，分別將樣本8w-1、3m-2、7m-1、Healthy-1的光譜數據作為預測組，各自與本組剩余犬（數據）及其它組一起構成對應訓練組。

3?結果與討論

3.1?光譜分析

圖1為對健康（Healthy）和OA 犬關節軟骨原位檢測的HOF-ATR-FTIR光譜。3276 cm1譜帶是Amide A帶（NH鍵的伸縮）[20]，1749 cm1表示CO的伸縮振動（來自于軟骨細胞中以及軟骨細胞周圍基質中的脂質）[21～24]，1338 cm1源自膠原的CH2振動[8，25]。Amide Ⅰ、Amide Ⅱ更多來自于膠原蛋白，而1079 cm1來自蛋白多糖（PG）[26]。軟骨中Amide III帶既不適用于軟骨膠原蛋白的含量表征，也不適用于PG的含量表征[26，27]。

健康和患關節炎7個月的犬關節軟骨的特征譜帶吸光度（積分面積）見表2。根據文獻[8]，OA病變6個月（與本研究中病變7個月時的病理狀況接近）時，關節軟骨中以Amide I表征的膠原的含量變化不明顯，因此，對比于健康關節軟骨，OA關節軟骨1/Amide I明顯降低，表明受OA影響，軟骨表層軟骨細胞內及周圍基質中的脂質含量減少，可能暗示著軟骨細胞在逐漸的退變或凋亡。Amide I/Amide II相對強度降低（2.78Healthy→2.12OA），表明OA關節軟骨表面膠原纖維的結構發生了改變[8]。1338 cm1/Amide II相對強度也降低（0.10 Healthy→0.05 OA），表明OA關節軟骨表面膠原蛋白的完整性發生了改變[8]。1079 cm1/Amide I的吸光度增加表明，隨著OA的發生，軟骨表面PG的含量增加。文獻[8]研究結果表明，病變6個月時，在軟骨細胞附近基質內，PG的含量隨著軟骨的退變而增加，膠原的含量變化不明顯，但膠原完整性下降; 同時受膠原結構變化影響，1338 cm1譜峰強度降低，本研究結果與之一致。此外，3276 cm1的含量發生變化的同時，肩峰的相對強度也明顯改變，表明Amide A也可能受OA的影響發生了含量的變化。

3.2?PCA-FDA

表3所示為PCA主成分累計貢獻率，可見經PCA降維，前4個主成分（包括膠原蛋白、蛋白多糖、水等成分[26]）的累計貢獻率即超過90%（達到92.11%），因此選擇前4個主成分因子進行FDA處理。

以8w-1犬的原位光譜數據為預測組，FDA分類結果及訓練組的交互驗證結果如表4所示，訓練組初始樣本均全部正確識別; 預測組樣本識別正確率為100%; 交互驗證案例的總識別正確率為97.8%。對誤判點進行分析發現，僅有的1個誤判點來自樣本8w-2軟骨端面明顯損傷點（圖2B），表明此位置膠原結構可能受到破壞，軟骨基質的成分和含量受到影響，導致被誤判為OA 7個月樣本。

以樣本3m-2犬的光譜數據為預測組時，訓練組初始樣本均全部正確識別; 預測組樣本全部正確識別; 交互驗證案例的總識別正確率為95.6%。對誤判點進行分析發現，一個誤判點來自樣本8w-1軟骨端面明顯損傷點（圖2A），類似上述樣本8w-2，此位置膠原結構也可能受到破壞，故導致此位置被判斷為來自病變7個月樣本; 另一個誤判點來自樣本7m-2軟骨端面相對正常位置（圖2C），軟骨的破壞程度相對整體而言較輕，導致將此位置被判斷為來自病變8周樣本。

以樣本7m-1犬的原位光譜數據為預測組時，訓練組初始樣本均識別正確率100%; 預測組樣本正確率100%; 交互驗證案例的總識別正確率為97.8%。對誤判點進行分析發現，僅有的一個誤判點來自樣本8w-2軟骨端面明顯損傷點（圖2B），與表4的FDA結果誤判原因一致。

以樣本Healthy-1犬的光譜數據為預測組時，訓練組初始樣本的識別正確率100%; 預測組樣本正確率100%; 交互驗證案例的總識別正確率為95.2%。對誤判點進行分析發現，一個誤判點來自8w-1樣本軟骨端面明顯損傷點（圖2A），另一個誤判點來自樣本7m-2軟骨端面相對正常位置（圖2C），發生誤判原因與以樣本3m-2犬的光譜數據為預測組時的FDA結果誤判原因一致。

根據上述PCA-FDA分析結果，各訓練組初始樣本均可100%正確識別，且對各預測組也均可準確識別，考慮到本研究所用樣本較少（每組2只犬），因此采用分組預測驗證。分別以不同時期樣本作為預測組時，交叉驗證的總識別正確率均超過95%，對出現誤差檢測點分析發現：（1）病變8周樣本誤判為來自病變7個月樣本（8w-1、8w-2）的檢測點均為所在軟骨端面明顯損傷點，因為此位置膠原纖維結構受到破壞，導致使所在點的光譜特征更接近病變7個月組而發生誤判; （2）病變7個月樣本誤判為來自病變8周樣本（7m-2）的檢測點為所在軟骨端面相對正常位置，此位置膠原纖維結果相對完整，導致所在點的光譜特征更接近病變8周組，進而發生誤判; （3）樣本差異及過擬合也可能是導致誤判發生的因素。綜上可見，HOF-ATR-FTIR光譜技術結合PCA-FDA方法有能力對不同病變階段的OA實現高精度分類鑒別。

OOCHAS評分是基于對軟骨損傷的深度和長度而進行綜合評估（分級×分期）的一種半定量評價方法，總分24分。將評分 ≤ 12分（共10個檔次）的樣本歸類為OA早期階段，而將評分>12分（5個檔次）的結果歸類為OA中晚期階段[3]。依此而言，本實驗經膝關節前交叉韌帶橫斷手術后培養的OA樣本中，病變8周（OOCHAS評分2分）、3個月（OOCHAS評分4分）樣本均處于OA早期[3]。客觀而言，OOCHAS評分標準更適合對OA早期進行較精細的評級，而僅將中晚期劃分為5個檔次，無形中模糊了對OA中期的精確劃分，將中期、晚期病變統一劃入了中晚期的范疇，這也是表1中病變7個月樣本（OOCHAS評分18分）被誤判為OA中晚期的原因。

相對于半定量的OOCHAS評分方法，基于組織切片病理染色的Mankins 評分標準更適用于對OA中晚期的評價 [3]，兩種主觀評分方法互補，可對OA的早中晚分期進行較均勻、全面的主觀評價。采用本研究建立的HOF-ATR-FTIR & PCA-FDA定量判別技術，必要時聯合內窺鏡技術進行在體原位探測，通過采集和豐富不同病變（分期）階段的OA光譜數據庫，或聯用其它診斷工具，在主客觀評判方法之間建立相關聯數據庫，將有望對疑似OA患者進行更客觀快速的分級/分期在體原位診斷。

17?Li G，Thomson M，Dicarlo E，Xu Y，Nestor B，Bostrom M P G，Camacho N P. Appl. Spectrosc.，2005，59（12）： 1527-1533

18?MAO Zhi-Hua，ZHANG Xue-Xi，WU Yue-Chao，YIN Jian-Hua，XIA Yan. Chinese J. Anal. Chem.，2015，43（4）： 518-522

毛之華，張學喜，吳曰超，尹建華，Xia Yan.?分析化學，2015，43（4）： 518-522

19?Mao Z H，Yin J H，Zhang X X，Wang X，Xia Y. Biomed. Optics Express，2016，7（2）： 448-453

20?Shao J，Lin L，Tang B，Du C. RSC Adv.，2014，4（93）： 51165-51170

21?Palukuru P，Mcgoverin C M，Pleshko N. Matrix Biol.，2014，38： 3-11

22?LI Li-Li，ZHAO Li-Jiao，ZHONG Ru-Gang. Spectroscopy and Spectral Analysis，2011，31（12）： 3194-3199

李莉莉，趙麗嬌，鐘儒剛. 光譜學與光譜分析，2011，31（12）： 3194-3199

23?Mansfield J，Moger J，Green E，Moger C，Winlove C P. J. Biophotonics，2013，6： 803-814

24?FU Zhi-Qiu，LIU Gang，OU Quan-Hong，YANG Wei-Mei，AN Ran，LI Jian-Mei，SHI You-Ming. Spectroscopy and Spectral Analysis，2018，38（S1）： 60-61

符致秋，劉 剛，歐全宏，楊衛梅，安 冉，李建美，時有明. 光譜學與光譜分析，2018，38（S1）： 60-61

25?Rieppo L，Tyrs J，Saarakkala S. Appl. Spectrosc. Rev.，2016： 1-18

26?XIAO Zhi-Yan，YIN Jian-Hua. Chinese Journal of Light Scattering，2014，26（2）： 213-218

肖芝燕，尹建華. 光散射學報，2014，26（2）： 213-218

27?Xia Y，Ramakrishnan N，Bidthanapally A. Osteoarthr. Cartilage，2007，15（7）： 780-788