新型比色熒光雙通道探針用于硫化氫的檢測

王肖莉 姚猛 李引 魏超 王美

摘?要?以7-硝基苯并呋咱（NBD）為熒光團，經一步有機合成，高產率制備比色熒光雙通道探針，用于檢測環境和體內硫化氫（H2S）的含量。以無水Na2S為H2S供體，考察了探針的選擇性、靈敏性等性能。結果表明，探針熒光強度與H2S濃度在5～50 μmol/L濃度范圍內呈良好的線性關系，檢出限為0.125 μmol/L，同時反應溶液由無色變為紫色。采用MTT法測試探針的細胞毒性，結果表明，在探針濃度低于50 μmol/L條件下，細胞存活率高于90%。激光掃描共聚焦顯微成像結果表明，探針可靶向細胞溶酶體，可對溶酶體內H2S進行成像研究。

關鍵詞?硫化氫; 比色檢測; 熒光探針; 細胞成像

1?引 言

硫化氫（H2S）是一種無色且具有臭雞蛋氣味的氣體，一般由工業中含硫物質非完全燃燒產生，被認為是一種有毒環境污染物。近年的研究發現，H2S是生命體內一種重要的內源性氣體信號分子，參與多種重要的生理過程[1～4]，H2S濃度異常與許多疾病有關，如阿爾茨海默氏癥、唐氏綜合癥、糖尿病和肝硬化等[5，6]。但是，其在體內的潛在分子機制尚不明確[7，8]。因此，基于H2S在環境和生命體內的重要作用，開發靈敏有效的分析方法具有重要的意義[9]。

傳統的H2S檢測方法包括吸收光譜法、電化學法、氣相色譜法和硫沉淀法等[10～13]，而光學探針法發展迅速。其中，比色法可不借助昂貴的儀器設備，直接對目標物裸眼分析; 熒光探針法選擇性好、靈敏度高，可對生物樣本（細胞、組織和活體等）內目標物進行實時熒光成像研究。基于H2S的化學性質（還原性、親核性等），研究者發展了多種反應型H2S熒光探針[14～16]，包括還原型（芳香疊氮/硝基/羥胺還原為胺基）[17～20]、親核型（親核取代[21，22]、親核加成/雙親核加成[23，24]）、形成CuS沉淀型[25]等。近年來，雖然已報道了大量H2S熒光探針，但是開發兼具制備簡便、選擇性好、靈敏度高等優點，并能夠實現比色和熒光雙通道檢測H2S的優良的探針分子，用于檢測環境和生物樣品中的H2S，仍然是當前的研究熱點。

2013年，本研究組[26]和Pluth研究組[27]分別發現7-硝基苯并呋咱（NBD）胺可與H2S發生親核取代反應，其產物NBD-SH可用于比色檢測H2S。基于此，利用多種光物理擾動原理，構建了系列選擇性檢測H2S的比色熒光雙通道探針[28～30]。進一步利用NBD優秀的熒光性質，本研究組[31]和易龍研究組[32]分別構建了以7-羥基香豆素連NBD為骨架結構的比例計量型H2S熒光探針，實現了細胞線粒體和溶酶體內H2S的比例成像研究。

考慮到上述探針分子需要多步有機合成進行制備，本研究以NBD為熒光團，嗎啉為溶酶體靶向基團，經一步有機反應，設計合成了新型比色熒光雙通道H2S探針NBD-M。此探針本身具有熒光，與H2S反應后的產物NBD-SH在水溶液中熒光較弱，因此，可產生由開到關的熒光變化; 同時，利用產物NBD-SH的顏色變化可比色檢測溶液中H2S。考察了探針的溶酶體靶向的功能，并測試了探針檢測細胞溶酶體內H2S的能力。

2?實驗部分

2.1?儀器與試劑

Brucker 600核磁共振儀（美國Brucker公司，TMS為內標）; Varian 7.0 T FTICR-MS質譜儀、UV-3600型分光光度計（美國Agilent公司）; F-7000型熒光光譜儀（日本日立公司）; PHS-3C型精密pH計（上海雷磁儀器廠）; ZF-7型三用紫外分析儀、X-4顯微熔點儀（上海精密儀器儀表有限公司）。4-氯-7-硝基苯并呋咱和嗎啉（阿拉丁試劑有限公司）; 其它試劑均購于天津光復試劑公司。所用試劑均為市售分析純，實驗用水為二次蒸餾水。

2.2?探針NBD-M的合成

將200 mg （1.00 mmol） NBD-Cl和91 mg （1.05 mmol）嗎啉溶解于10 mL二氯甲烷，向其中加入209 μL （1.50 mmol）三乙胺，室溫反應1 h后，加入10 mL水，萃取，有機相加入無水Na2SO4干燥，蒸除溶劑，所得粗品用硅膠柱分離（二氯甲烷-甲醇，100∶1，V/V）得淡紅色固體，產率90%。熔點：147.2～148.5℃。1H NMR （DMSO-d6，600 MHz），δ （ppm）： 8.51 （d，J=9.0 Hz，1H），6.68 （d，J=9.0 Hz，1H），4.13～4.12 （m，4H），3.85～3.83 （m，4H）。 13C NMR （DMSO-d6，151 MHz），δ （ppm）： 14539，14475，14473，13621，12136，10342，6567，4947。 MS （ESI+） calcd for [M+H+]?341.1，found 341.2。探針NBD-M的合成路線見下式。

2.3?光譜測試

配制2 mmol/L探針的DMSO溶液，在室溫下、磷酸鹽緩沖溶液（PBS，pH 7.4，0.02 mol/L）中進行光譜測試，探針濃度為 10 μmol/L，激發波長為490 nm，激發和發射狹縫寬度均為5 nm。選擇性測試所需各種潛在干擾物質均溶于純PBS，測試濃度為200 μmol/L。

2.4?細胞成像

細胞培養實驗方法和條件參見電子版文后支持信息。HeLa細胞接種于35 mm細胞成像專用玻底培養皿，成像細胞密度為2×104。加入NBD-M （10 μmol/L）和商品化溶酶體定位探針Lyso-Tracker Red （20 nmol/L）共孵育30 min，用PBS洗滌3次后，進行共定位成像研究。探針NBD-M熒光通道激發波長為488 nm，發射波長范圍500～550 nm; Lyso-Tracker Red熒光通道激發波長為546 nm，波長采集范圍590～640 nm。

3?結果與討論

3.1?探針的光譜性質

探針的熒光性質是探針熒光檢測和成像的基礎。考察了不同溶劑對探針紫外吸收和熒光發射光譜的影響。隨著溶劑極性增加，探針的最大紫外和熒光發射均發生紅移（電子版文后支持信息表S1）。如圖1所示，在PBS中，探針的最大紫外吸收和熒光發射分別為496和576 nm，斯托克斯位移高達80 nm，在實際應用中可有效避免激發光對檢測光譜信號的干擾。

3.2?探針對H2S的識別性能研究

在PBS （ 0.02 mol/L，pH 7.4）溶液中，探針的最大紫外吸收峰強度在探針濃度0～4.0 × 104 mol/L范圍內線性關系良好（r=0.9993），表明探針具有良好的水溶性（電子版文后支持信息圖S2）。如圖2所示，將探針溶液（ 10 μmol/L）和新配H2S 溶液（200 μmol/L）混合，30 min后反應體系的熒光信號基本穩定。計算所得探針與H2S反應的假一級反應動力學常數（kobs）約為2.1 × 103 s1，二級反應動力學常數（k2）為10.5 L/（moL·s），與其它NBD基親核取代型H2S熒光探針的常數的數量級相當[18，26]，表明探針可作為一種快速檢測H2S的熒光關閉型探針。

Na+、Ca2+、Fe2+、Ba2+、Mg2+、Cu2+、F、Cl、Br、I、NO3、SO24、NO2、HClO、Vc、KO2、SO23、H2O2、Hcy、Cys、GSH、H2S），測試其熒光發射光譜（λex=490 nm）。如圖3所示，H2S可使探針的熒光顯著降低，而其它物質不會明顯改變探針的熒光強度，表明探針NBD-M對H2S的熒光響應具有較高的選擇性。

為了評估探針對H2S的檢測靈敏性，進行了熒光滴定實驗。向探針溶液（10 μmol/L）中依次加入不同濃度（0～100 μmol/L）的新配H2S溶液，孵育15 min，探針與576 nm處的最大發射峰熒光強度逐漸增強（圖4Α）。如圖4B所示，在5～50 μmol/L濃度范圍內，H2S的濃度與探針的熒光強度呈現良好的線性關系，其線性方程為y=266.13-3.43x （r=0.9942），檢出限為0.125 μmol/L （S/N=3），與已報道文獻相當[26]。上述結果表明，探針NBD-M可定量檢測H2S的濃度，具有較高的靈敏度。

探針與H2S反應后，探針最大紫外吸收峰發生明顯紅移（電子版文后支持信息圖S3）。文獻報道，探針與H2S反應后，產物NBD-SH具有明顯的顏色[26，27]。向探針溶液（10 μmol/L）中加入0、10、20、30、40、50、75 和100 μmol/L的新配H2S溶液，室溫孵育5 min后，可明顯觀察到溶液由淡黃色變為紫色，并且隨著H2S加入量的增加，溶液紫色逐漸加深（圖5）。基于探針溶液的顏色變化與不同H2S濃度之間的相關性，可簡便地半定量檢測水樣中20 μmol/L H2S。因此，探針NBD-M可實現對H2S的比色和熒光雙通道檢測。

3.3?探針對H2S的識別機制研究

為了研究探針與H2S的識別機制，向探針溶液中加入等摩爾數的H2S，測試了探針與H2S反應前后的核磁共振氫譜。探針1位和2位芳香氫的化學位移分別為6.67和8.51 ppm，與H2S反應后，此位置芳香氫的化學位移分別7.00 ppm和8.07 ppm移動到7.42 ppm。結合探針與H2S反應的紫外吸收光譜和溶液顏色變化，推測探針與H2S發生如圖6所示的親核取代反應。

3.4?探針對細胞內H2S熒光成像研究

熒光關閉型熒光探針已被報道用于內源性H2S的成像研究[33～35]。利用四唑鹽（MTT）比色法，對探針的細胞毒性進行評價，發現探針在濃度低于50 μmol/L時，細胞存活率高于90%，可用于細胞實驗研究（電子版文后支持信息圖S4）。

一些小分子胺類基團（如嗎啉、N，N-二甲基胺等）本身具有堿性，含有此類結構的熒光探針能夠選擇性地積累在弱酸性細胞器，實現溶酶體定位功能。利用商品化溶酶體定位探針（Lyso-Tracker Red）進行細胞器共定位成像研究。如圖7所示，向HeLa細胞加入含有20 nmol/L共定位探針Lyso-Tracker Red和10 μmol/L探針NBD-M的培養基，共孵育15 min，可觀察到兩個探針光譜重疊良好，共定位皮爾森相關系數為0.93[36]，表明探針具有良好的溶酶體定位能力。

利用探針對細胞內H2S進行熒光成像研究。如圖8所示，HeLa細胞在含有10 μmol/L探針的培養基中孵育15 min，可觀察到明顯的黃色熒光（圖8A）; 先孵育100 μmol/L H2S 30 min，再孵育探針15 min，黃色熒光明顯降低（圖8B）; 先孵育200 mol/L H2S 30 min，再孵育探針15 min，黃色熒光基本完全消失（圖8C）。熒光成像實驗表明，探針NBD-M能夠用于HeLa細胞溶酶體內H2S的成像研究。

4?結 論

合成了一種新型比色-熒光雙通道探針NBD-M，能夠高選擇性和高靈敏識別H2S。探針與H2S反應后，溶液顏色由無色逐漸變為紫色，能夠裸眼檢測含20 μmol/L H2S的水樣，具有一定的應用前景。此探針能夠靶向HeLa細胞溶酶體，可用于細胞內H2S的成像研究。

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