基于熒光共振能量轉移構建關-開型復合熒光探針快速檢測沙門氏菌

崔雯雯 徐琳琳 史艷宇 董娜 陳萍

摘?要?將經硅烷化以及氨基化修飾的功能化磁珠與沙門氏菌特異性抗體進行偶聯，制備功能化免疫磁珠，通過近紅外光譜、熒光光譜、紫外光譜等技術對其進行結構和活性表征。將功能化磁珠、抗體和量子點（QDs）進行有序組裝，構建了集磁性富集分離和檢測于一體的磁珠-抗體-QDs復合熒光納米探針。基于此復合熒光納米探針中的QDs與金納米粒子（AuNPs）間的熒光共振能量轉移 （FRET） 效應，建立了快速檢測沙門氏菌的“關-開”型熒光分析方法。結果表明，復合熒光納米探針的熒光恢復度與菌濃度的對數值呈良好的線性關系，線性回歸方程為y=103.5x+121.4（R2=0.9956），檢出限為102 CFU/mL（S/N=3），檢測時間少于2 h。本方法特異性好，檢出限低，靈敏度高，可滿足食品中沙門氏菌快速檢測的需求。

關鍵詞?復合熒光納米探針;熒光共振能量轉移;快速檢測;沙門氏菌

1?引 言

沙門氏菌（Salmonella）為腸桿菌科的革蘭氏陰性短小桿菌[1]，是引起食源性疾病的主要人畜共患病原菌之一[2]，常通過受污染的食物傳播，是主要的公共衛生威脅[3]，可引起腸胃炎、傷寒、敗血癥等多種疾病[4，5]，嚴重時可導致休克及意識障礙[6～8]。沙門氏菌的快速檢測一直是世界各國關注的問題。我國國家標準GB4789.4-2016 《食品微生物學檢驗沙門氏菌檢驗》[9]中的方法需要對病原菌進行分離培養、生理生化鑒定，操作步驟繁瑣，檢測周期長，一般需要4～7 d才能確定檢測結果[10]，不能滿足預防與監控中快速檢測的需求。因此，建立簡單、安全、快速的沙門氏菌檢測方法備受關注[11，12]。

目前，沙門氏菌的快速檢測方法主要包括聚合酶鏈式反應（PCR）[13，14]、核酸探針技術[15]、酶聯免疫吸附測定（ELISA）[16]、表面等離子體共振（SPR）[17]等。雖然這些方法在檢測速度、靈敏度以及特異性等方面較傳統方法有了明顯提高，但大部分檢測方法需要大型的精密儀器以及繁瑣的樣品前處理過程，在現場快速檢測方面受到了很大限制。隨著納米技術的發展，納米材料因其優異的性能獲得了廣泛關注。研究者將納米材料與熒光技術相結合，用于微生物的快速檢測。1998年，Bruchez等[18]以及Warren等[19]將量子點（Quantum dots，QDs）作為熒光標記物，用于生物診斷與檢測領域。Wang 等[20]利用沙門氏菌特異性抗體和金黃色葡萄球菌特異性抗體修飾 Fe3O4磁性納米材料，分別用于分離食品體系中的沙門氏菌和金黃色葡萄球菌，結合表面拉曼散射分析，方法檢出限達到103 CFU/ mL。熒光共振能量轉移（Fluorescence resonance energy transfer，FRET）是一種非輻射能量轉移形式，供體基團在激發狀態下，通過電偶極子的相互作用，將能量從供體轉移到受體。金納米粒子（AuNPs）具有良好的生物相容性和穩定性，消光系數高，在FRET體系中可作為能量受體[21]。FRET基于其檢測速度快和靈敏度高的優勢，近年來廣泛應用于免疫傳感、核酸檢測和微生物檢測等多個領域。Jin等[22]開發了一種基于上轉換熒光納米粒子的新型FRET適配體傳感器檢測細菌，對大腸桿菌ATCC 8739的檢測范圍為5～106 CFU/mL，檢出限為3 CFU/mL，并用于食品及水樣中大腸桿菌的檢測。免疫磁珠 （Immunomagnetic beads，IMBs） 是一種較好的免疫測定固相載體，操作簡便快速。Xiong等[23]將大腸桿菌單克隆抗體與磁珠偶聯用于捕獲碎牛肉和牛奶中的大腸桿菌O157：H7，捕獲效率分別為94.4%和99.8%，靈敏度高，特異性好。

本研究基于QDs與AuNPs之間的FRET效應，建立了“關-開”型熒光探針免疫分析方法。原理如圖1所示，將功能化磁珠、抗體和量子點進行組裝，構建“磁珠-抗體-量子點”復合熒光納米探針。此熒光探針中經巰基丙酸修飾后的量子點含有羧基（COOH），帶負電荷;經巰基乙胺修飾后的金納米粒子溶液（CS-AuNPs）含有氨基（NH2），帶正電荷，兩種納米材料由于靜電作用拉近了彼此間的距離，且AuNPs的吸收光譜與QDs的發射光譜有很好的重疊，可發生有效的FRET[24]，熒光探針的熒光被顯著淬滅。加入目標菌后，目標菌通過抗原抗體反應與熒光探針結合，熒光探針與CS-AuNPs之間的距離增大，FRET效應被削弱，因FRET而淬滅的熒光信號恢復。本研究基于QDs和AuNPs間的FRET效應構建熒光關-開體系，建立了快速檢測沙門氏菌的關-開型熒光探針免疫分析技術。此方法受背景基質干擾低，具有選擇性高、快速、靈敏的優點，為沙門氏菌的快速檢測提供了一種準確有效的方法。

2?實驗部分

2.1?儀器與試劑

COIC熒光顯微鏡（重慶光電儀器有限公司）;傅立葉近紅外光譜儀、Zeta電位分析儀、UV1800紫外可見分光光度計（日本島津公司）;F-4500 型熒光分光光度計（日本日立公司）。

巰基乙酸（TGA，上海國藥集團試劑有限公司）;3-氨丙基三乙氧基硅烷（APTES）、N-羥基琥珀酰亞胺（NHS）、正硅酸乙酯（TEOS）、氯金酸（HAuCl4·4H2O）、1-乙基（3-二甲基氨基丙基）碳二亞胺鹽酸鹽（EDC·HCl），均購于阿拉丁公司;沙門氏菌抗體（博士德生物工程有限公司）;巰基丙酸（MPA）修飾的CdTe量子點溶液（0.05 μmol/L，天津倍思樂色譜技術開發中心）;實驗菌種沙門氏菌 （ASII859）、福氏志賀菌（CMCC51252）、金黃色葡萄球菌（ASII861）、大腸桿菌（LE392）等均由吉林農業大學食品安全教研室保藏。所用試劑均為分析純;實驗用水為超純水（>18.0 MΩ cm）。

2.2?Fe3O4@SiO2@NH2的制備

采用共沉淀法[25，26]制備裸磁珠（Fe3O4）和經SiO2包被的氨基化磁珠（Fe3O4@SiO2@NH2）。對Fe3O4和Fe3O4@SiO2@NH2進行近紅外光譜表征分析，將Fe3O4@SiO2@NH2與抗體進行偶聯制得免疫磁珠。取50 mL裸Fe3O4磁珠，加入50 mL無水乙醇和2 mL TEOS，通氮氣，于60℃下攪拌反應10 h，磁分離，用無水乙醇和超純水分別洗滌3～5次，定容至100 mL。取50 mg上述磁珠，用4 mL PBS緩沖液分散，超聲30 min，加入2.5 mL 25%戊二醛，室溫振蕩反應3 h，用PBS緩沖液清洗3遍，最終將活化后的磁珠分散于緩沖液中，得到10 mg/mL Fe3O4@SiO2@NH2溶液。取1 mL（約10 mg）上述活化后的磁珠，加入6 mL沙門氏菌特異性抗體（1∶500稀釋），室溫振蕩反應2 h，用PBS緩沖液洗滌3次，制得沙門氏菌特異性免疫磁珠，于4℃保存。

2.3?復合熒光納米探針的構建

取等量0.024 mol/L Na2S溶液和0.032 mol/L ZnCl2溶液，在快速攪拌并通氮氣條件下逐滴交替滴加到MPA修飾的CdTe QDs溶液中，在60℃條件下密閉攪拌反應1 h，得到MPA-CdTe@ZnS QDs溶液。將溶液轉移到干凈干燥的玻璃瓶中，密封后，在室溫下靜置。將制備好的QDs溶液與等體積的丙酮混勻，振蕩5 min，10000 r/min離心5 min，用超純水離心洗滌沉淀，再用超純水懸浮，備用。

用EDC/NHS活化QDs表面的羧基。取100 μL MPA-CdTe@ZnS QDs溶液，向其中加入28.75 μL EDC（33.4 mmol/L，使用前現配）和27 μL NHS（70.9 mmol/L）溶液。充分混勻，在室溫振蕩反應15 min。取45 μL合成的免疫磁珠，加入到活化后的MPA-CdTe@ZnS QDs溶液中，25℃恒溫避光輕微振蕩反應2 h，然后進行磁分離，用PBS緩沖液重復洗滌3次，制得復合熒光納米探針，于4℃下儲存，備用。

2.4?金納米粒子的合成

根據文獻[27]的方法制備34 nm的巰基乙胺修飾的金納米粒子（CS-AuNPs）：將0.213 mol/L半胱胺鹽酸鹽和50 mL 1.4 mmol/L HAuCl4混合，在室溫避光攪拌20 min后，迅速加入12.5 μL 10 mmol/L新制備的NaBH4溶液，繼續劇烈攪拌30 min，制得的酒紅色溶液用0.45 μm的微孔濾膜過濾后，于4℃保存。34 nm 的金納米粒子的摩爾消光系數為6.06×109 L/（mol·cm） [28]，由朗伯比爾定律可知，CS-Au NPs的濃度約為 0.83 nmol/L。

2.5?特異性抗體與AuNPs結合pH的優化

取數個1.5 mL離心管，分別加入1 mL CS-AuNPs，用0.1 mol/L K2CO3溶液分別調節至pH 4、5、6、7、8、9、10，分別加入到96孔板的孔中，并做3個平行，在每個CS-AuNPs的孔中各加入6 μL稀釋后的特異性抗體，混勻后靜置5 min，再加入100 μL 10% NaCl溶液，室溫靜置10 min，觀察溶液顏色的變化，并測定上清液在520 nm處的吸收值（OD）。

2.6?復合熒光納米探針與金納米粒子結合體積比的優化

取10個1.5 mL 離心管，分別對其進行1～10標號，分別加入CS-AuNPs溶液100 μL，然后依次加入1、2、4、8、16、32、64、128、256、512倍比稀釋后的CS-AuNPs各10 μL，混勻后在室溫下放置15 min，再加入100 μL 10% NaCl，混勻后靜置5 min，測定其在520 nm處的吸收值。

2.7?熒光關-開型檢測方法的建立

2.7.1?復合熒光納米探針對沙門氏菌的檢測?取100 μL CS-AuNPs溶液于EP管中，加入10 μL復合熒光納米探針，混合均勻后，于室溫靜置15 min，進行磁分離。取9個1.5 mL 離心管，1號管為空白管，2～9號管分別加入1 mL菌液濃度為1×101、1×102、1×103、1×104、1×105、1×106、1×107、1×108 CFU/mL的沙門氏菌菌液，再分別取100 μL 被CS-AuNPs淬滅后的復合熒光納米探針加入各管中，將上述溶液恒溫振蕩反應20 min，磁分離，洗滌3次后，測定各溶液的熒光強度。

2.7.2?選擇性實驗?以沙門氏菌為目標菌，大腸桿菌、志賀氏菌、金黃色葡萄球菌為非目標菌，用建立的沙門氏菌的熒光關-開檢測方法對其進行檢測，考察此檢測方法的特異性。

2.7.3?人工模擬污染沙門氏菌牛奶樣品的檢測?按照國標GB4789.4-2016《食品微生物學檢驗檢驗沙門氏菌》[9]的檢測步驟對市售新鮮牛奶進行檢測，證實牛奶中不含沙門氏菌。分別隨機取不同濃度的沙門氏菌菌懸液加入到新鮮的牛奶樣品中，37℃恒溫培養箱中培養18 h。用建立的熒光關-開方法進行檢測，同時進行平板菌落計數。

3?結果與討論

3.1?Fe3O4和Fe3O4@SiO2@NH2的的表征

利用近紅外光譜（FT-IR）對裸磁珠（Fe3O4）和硅烷化氨基化修飾的磁珠（Fe3O4@SiO2@NH2）進行表征（圖2），由圖2a可知，在574 cm1出現了一個較強的吸收峰，為處于氧四面體位和氧八面體位的FeO伸縮振動峰。通常Fe3O4的吸收峰在580 cm 1處，其微小差距可能由于納米顆粒的尺寸效應，基團頻率發生位移，由此證明樣品的物相是Fe3O4。在圖2b中，在3402 cm1處的強吸收峰歸屬于羧基中的OH鍵的伸縮振動，表明修飾后的磁珠表面引入了OH。1080 cm1處較強的吸收峰是SiOSi鍵的伸縮振動峰，800 cm1處為SiO的伸縮振動峰，表明SiO2成功包裹在Fe3O4磁珠表面。在3402 cm1處出現NH2的特征吸收峰，在1633 cm1處出現NH鍵的彎曲振動峰，表明氨基已成功修飾在Fe3O4磁珠表面。近紅外光譜結果表明，Fe3O4磁珠已成功包被SiO2，并在表面修飾上氨基。

3.2?MPA-CdTe QDs和MPA-CdTe/ZnS QDs的光譜表征

圖3為MPA-CdTe QDs和MPA-CdTe@ZnS QDs的吸收光譜（A）和熒光光譜（B）。由圖3A可知，MPA-CdTe QDs吸收峰位于446 nm處，MPA-CdTe@ZnS QDs的吸收峰位于456 nm處，與未修飾ZnS的MPA-CdTe QDs相比，MPA-CdTe@ZnS QDs吸收峰紅移10 nm。由圖3B可知，MPA-CdTe QDs和MPA-CdTe@ZnS QDs的熒光發射峰位于516 nm，修飾ZnS殼后，MPA-CdTe@ZnS QDs的熒光強度增加。

3.3?金納米粒子對復合熒光探針淬滅條件的優化

優化了特異性抗體與 CS-AuNPs結合pH值以及淬滅劑CS-AuNPs用量。隨著pH值增大，溶液在520 nm處的吸光度先增大后減小，顏色由藍紫色變為紅色，再變為藍色，pH=8時吸光度最大，此時CS-AuNPs無明顯變化，pH=9、10時，吸光度開始減小。當0.1 mol/L K2CO3加入量為40 μL時，溶液的吸光值最大，因此確定熒光探針與CS-AuNPs結合的最佳pH=8。考察了不同濃度的金納米與抗體結合的最佳稀釋梯度，確定CS-AuNPs標記最適抗體稀釋度為15倍，此時熒光探針的熒光處于淬滅狀態。

3.4?金納米粒子對量子點的熒光淬滅機制

如圖4A所示，CS-AuNPs最大吸收峰位于524 nm，光譜呈現出不對稱分布狀態，與文獻[29，30]報道相一致。FRET的發生需要兩個條件[31]： 一是存在合適的能量供體和受體; 二是供受體間的距離足夠近（< 10 nm）。本研究制備的CS-AuNPs的吸收光譜與量子點的熒光發射光譜存在較大重疊，這為FRET提供了基礎，且發現隨著受體CS-AuNPs濃度的增加，其吸收強度逐漸增加，而供體的熒光發射強度逐漸降低，FRET效應具有濃度依賴的現象。由熒光探針淬滅前后熒光光譜（圖4B）可知，加入CS-AuNPs后，探針的熒光強度明顯降低，熒光發生淬滅。由圖4C和4D可知，在最佳pH條件下，體系中CS-AuNPs與QDs的Zeta電位分別為35.7和15.4 mV，進一步證明由于靜電引力，兩者可發生有效的FRET。

3.5?基于復合熒光納米探針關-開效應檢測沙門氏菌

在檢測體系中加入沙門氏菌，振蕩反應20 min后，測定其熒光強度。

如圖5所示，隨著沙門氏菌濃度增加，復合熒光納米探針的熒光逐漸恢復。體系的熒光恢復程度（F-F0）與菌液濃度的對數呈線性關系，線性方程為y=103.5x+121.4（R2=0.9956），檢出限為1.7×102 CFU/mL（S/N=3）。

為了驗證此體系的選擇性，考察了非目標菌（Shigella flexneri，Escherichia coli，Staphylococcus aureus）對體系的影響情況。如圖6A所示，隨著沙門氏菌濃度增加，復合熒光納米探針溶液的熒光強度逐漸增大，而非目標菌的加入，未引起體系熒光強度明顯改變。圖6B分別是加入目標菌和非目標混合菌后的熒光顯微鏡下圖片。通過明視場與暗視場間的對比，圖6B-b中菌體發出熒光，說明被淬滅的熒光得到恢復;圖6B-d幾乎觀察不到熒光，說明非目標菌沒有使淬滅的熒光恢復。上述結果表明，本方法對沙門氏菌的檢測具有良好的特異性。

3.6?牛奶樣品中沙門氏菌的檢測

用復合熒光探針對人工模擬污染沙門氏菌的牛奶樣品進行檢測，并與國家標準沙門氏菌平板計數法[9]的檢測結果進行比較，結果見表2。兩種方法得出的數值基本一致，由圖7可知，兩種方法測定結果的線性相關方程為y=1.0029x-0.0184（R2=0.9998），表明本研究構建的檢測體系可用于沙門氏菌的定量檢測。

4?結 論

利用量子點和AuNPs間的FRET效應，建立了快速檢測沙門氏菌的關-開型復合熒光納米探針分析方法。構建了集磁性富分離和檢測結果快速呈現功能于一體的“磁珠-抗體-量子點”復合熒光納米探針，通過供體-受體自組裝完成熒光淬滅，沙門氏菌通過抗原抗體反應與探針結合，使金納米粒子與探針之間的距離增大，FRET效應減弱，實現熒光的turn-on響應。結果表明，熒光探針的熒光恢復度與菌液濃度的對數呈現良好的線性關系，檢出限為102 CFU/mL，檢測時間在2 h以內。本方法操作簡單，特異性好，靈敏度高，滿足快速檢測食品中沙門氏菌的需求，具有良好的實際應用前景。

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