木本植物組織培養①

吉訓志 秦曉威 胡麗松 王曉陽 李付鵬 郝朝運

(中國熱帶農業科學院香料飲料研究所/農業部香辛飲料作物遺傳資源利用重點實驗室/海南省熱帶香辛飲料作物遺傳改良與品質調控重點實驗室 海南萬寧 571533)

植物組織培養技術起初來源于1905年德國植物學家Haberlandt提出的植物細胞具有全能性的概念，即指植物的每個細胞都具有母體的全套遺傳信息，擁有能夠發育成完整植株的能力，在適宜的條件下，任一細胞都能發育成新個體，植物細胞全能性是植物組織培養的理論基礎[1-2]。自Steward等[3]和Reinert[4]利用胡蘿卜離體根細胞，經過組織培養下發育成體細胞胚，進而發育成完整植株以來，植物離體再生技術就不斷受到國內外學者的關注。植物離體再生的一般過程主要是離體的植物組織，在適宜的培養條件下，通過脫分化形成愈傷組織，愈傷組織進一步發育成體細胞胚，然后體細胞胚經歷類似合子胚的發育過程，最終再生成完整植株。近年來，在許多木本植物上都已成功進行了植物組織培養研究， 如桃樹[5]、 蘋果[6]、 梨樹[7]、 荔枝[8]等植物的離體再生技術的研究上都取得了重要的研究成果。雖有一些木本植物已成功建立離體再生體系，但仍有不少木本植物的組織培養研究與組培苗進一步產業化上存在著問題。因此，有必要對木本植物組織培養中的再生方式、關鍵因素與突出問題等方面研究進行概括與分析，這將有利于木本植物組織研究進一步開展，并提供理論參考。

1 木本植物組織培養中再生方式

1.1 器官發生

植物器官發生是指離體的植物組織，如莖段、莖尖與頂芽等部位，不經過誘導愈傷組織的去分化過程，直接誘導叢生芽與不定根，再生成完整植株的過程。植物的外植體來源及其所處的發育階段，與不同部分的極性都是影響器官發生的主要因素。并且器官發生對于培養基中細胞分裂素與生長素的比例有著很高的要求，不同的比例常常確定器官發生的方向，這在本文的激素部分已進行了論述。而光照、溫度等誘導條件對于植物器官發生也起著重要調控作用，不定芽的生長分化通常需要充足的光照條件，且充足的光照可避免玻璃化苗的出現。

1.2 體細胞胚誘導

體細胞胚誘導是指在植物組織培養中，以植物組織、器官或原生質體等為外植體，經過特定的培養條件，組織細胞脫分化形成快速生長分裂的細胞團，即愈傷組織。然后愈傷組織進一步生長分化，再分化成具有與合子胚一樣能夠發育成完整植株的無性胚狀體結構，稱為體細胞胚。

在木本植物組織培養的研究中，大多數的木本植物都是需要通過體細胞胚誘導來完成植株的再生。況且誘導體細胞胚能夠極大地發揮植物細胞的再生分化潛力，在荔枝[9]、龍眼[10]與蘋果[11]等果樹的組織培養中，通過大量增殖愈傷組織，能夠誘導獲得大量體細胞胚，每個體細胞胚都具有發育成完整植株的潛力，并且可以將這些體細胞胚制作成人工種子，做到對優良種苗資源的高效繁育，蘊含著極大的經濟價值。但大量木本植物的體細胞胚誘導，存在體細胞胚誘導困難與誘導體細胞胚不正常的問題，這是制約木本植物組織培養技術發展的瓶頸。

體細胞胚誘導除了與上述外植體、植物激素、培養條件等有著密切的關系，植物的基因型也是一個重要的影響因素。在一種植物的不同品種中，各個品種的體細胞胚發生能力不同[12]。體細胞胚誘導很大程度上取決于愈傷組織的胚性，胚性強的愈傷組織能夠自發地分化成高質量的體細胞胚。因此，選用分生能力旺盛的外植體，在適宜的培養條件與激素條件下，獲得并保持高胚性的愈傷組織，是體細胞胚誘導的關鍵。并且體細胞胚誘導在基因轉化技術發展方面，能夠提供良好的物質基礎。

1.3 體細胞胚再生

體細胞胚再生是指體細胞胚經歷類似合子胚發育過程，進一步發育成完整植株的階段。這是植物組織培養技術中最關鍵的一步，之前對所有因素的探索，都是為了能夠獲得再生植株。在體細胞胚再生過程中，大多數學者會將培養基中的基本元素與營養物質減半，或不添加任何的植物激素，以充分發揮體細胞胚自身的分化能力[13]。因此，獲得高質量的體細胞胚是植株再生成功很重要的關鍵。

從外植體誘導獲得愈傷組織，愈傷組織再進行體細胞胚發生，最后體細胞胚經過生長萌發成擁有根、莖、葉的完整植株，此過程都是在無菌培養條件下進行的異養培養。而再生植株最終是需要進行移栽，自我生長成正常的種苗。從異養到自養的過程中，再生植株需要經歷一個適應階段，不同植物品種的適應能力不同，導致移栽成活的難易程度不一。

1.4 再生植株移栽

再生植株的根系、葉片與莖段等植物器官對于移栽成功十分重要。開瓶煉苗是植株移栽過程中的過渡階段，目的在于讓再生苗預先適應外部環境，光照強度不宜過強，以保護新生的葉片，且避免過強的蒸騰作用，造成葉片萎蔫，使再生苗脫水死亡[14]。而根系中的側根是植株能夠從土壤中吸取養分的最重要組織器官，因此誘導再生植株長出側根發達的根系對于移栽成活至關重要。

2 木本植物組織培養中的關鍵因素

2.1 基本培養基

在對植物進行組織培養研究時，首先需考慮培養基選擇的問題，而基本培養基的選擇是在研究中優先被考慮。現今，依照基本培養基的成分與元素的濃度，大致分為4個類型：富集元素平衡培養基(包括 MS、LS、BL、ER等)， 高硝酸鉀含量培養基(包括 B5、N6、SH等)，中等無機鹽含量的培養基(包括 H、Nitsch、Miller等)和低無機鹽培養基(包括White、WS、HE等)[15]。在絕大多數的植物組織培養中，通常選擇MS培養基作為基本培養基，但也需要參照目標植物的近緣物種的相關研究成果進行選擇基本培養基。不過，在一般情況下，植物能夠適應多種基本培養基，但不同的誘導培養目的，選擇最佳的基本培養基不同。

趙雪惠等[16]在對麻瘋樹的組織培養研究中，以幼胚為外植體，去除胚乳，接種MS、LM、WPM、N6 4種未添加任何植物激素的培養基上進行培養，發現N6早生出胚根，而MS與WPM能夠大量誘導出愈傷組織，并且WPM培養基上的分化不定芽數量最多，在不定芽生根中，以LM與WPM培養基的生根誘導率最高，不過WPM培養基上的主根較少，側根系發達，因此WPM培養基是最佳培養基。雖然基本培養基在植物組織培養中起到支撐作用，但各種培養基都包含了植物生長所需的基本元素，只是其濃度比例不一，并且在實際培養中仍需添加激素、抗氧化劑或一些物質進行補充，使得培養效果達到最佳。

2.2 植物激素

在1905年德國植物學家Haberlandt提出植物細胞具有全能性的概念時，植物組織培養技術就已經開始發展，不過其技術發展歷程十分艱辛與緩慢，很大的原因是當時尚未發現對植物細胞生長分化起著促進作用，但其濃度很低的物質，后來這類物質被稱為植物激素。目前，天然植物激素因其主要的調控作用，被分為5類：生長素、細胞分裂素、赤霉素、乙烯和脫落酸[17]。由于天然植物激素在植物體內含量極微，因此想從天然來源提取激素十分困難且不經濟。在了解天然植物激素化學結構后，現如今已經可以大量人工合成植物激素，并對原有結構進行改變，制成活性更強的植物激素類似物，如常用的2，4-D(2，4-二氯苯氧乙酸)、NAA(萘乙酸)與KT(激動素)等物質。自植物激素運用以來，植物組織培養技術不斷實現對不同品種植物的離體再生，獲得完整植株。

2.2.1 生長素

生長素是最早被發現的一類植物內源激素，參與了植物根和莖的發育、器官的衰老與維管束組織的形成等方面的植物生長分化過程。在植物組織培養研究中，常用的生長素主要包括IAA(吲哚乙酸)、IBA(吲哚丁酸)、NAA、2，4-D，其中以2，4-D的活性最強，濃度過高，易引起遺傳變異。并且過高的生長素濃度會對木本植物誘導芽增殖起到抑制作用[18]。

王慧梅等[19]在對不同生長素影響喜樹組培苗生根的研究中發現，IBA比NAA對誘導生根效果要好，但兩者濃度過高都會對生根造成抑制效果，最佳的濃度為IBA 0.5 mg/L。而在對紅松的組織培養研究中，也獲得了相似的結果，在生長素類激素含量較高時發生不定根[20]。何業華等[21]在對棗樹愈傷組織形成的不定芽進行不定根誘導的研究中發現，IBA效果最好 ,其次是 IAA,NAA生根率低，并且仍會有大量愈傷組織生成，而2，4-D主要以愈傷組織誘導為主。

2.2.2 細胞分裂素

細胞分裂素是在組織培養中另一種重要的植物內源激素，通常與生長素一起使用，兩者相輔相成，能夠達到更好的培養效果。細胞分裂素大致可分成兩類,一類是嘌呤型細胞分裂素(CTK),另一類是苯基脲型細胞分裂素(PUD)。植物組織培養中常用的第一類嘌呤型細胞分裂素，包括BA(芐基腺嘌呤,又稱 6-BA,BAP)，KT(激動素,KIT,KIN)，2IP(2-異戊烯基腺嘌呤)，ZEA(玉米素,即異戊二烯腺嘌呤,又稱ZT)。苯基脲型細胞分裂素是新型的細胞分裂素，其中TDZ(噻苯隆)是人工合成的一種植物激素，因具有高度的細胞分裂素活性，也常被使用。在對紅松和棗樹的組織培養研究中，發現細胞分裂素BA對誘導不定芽的效果較好，不過BA會抑制不定根的產生。楊振國等[22]在防止酸櫻桃組培苗玻璃化的研究中，發現BA會提高玻璃化率，而KT對玻璃化無影響。Huetteman等[23]在探討TDZ對于木本植物組織培養中的影響認為，TDZ能夠促進許多再生困難的木本植物品種完成微繁殖過程，在濃度低于1 μmol/L時，能夠使腋芽增殖，但可能抑制芽的伸長；在濃度高于1 μmol/L時，能夠刺激愈傷組織的形成、誘導叢生芽與體細胞胚發生。

2.2.3 赤霉素

赤霉素至今已發現100多種，總稱為赤霉素類(GAs)。其中只有少數赤霉素對植物的生長發育具有生物活性，在木本組織培養的研究中應用較多的是GA3。GA3的作用類似于生長素，但與其不同的是，GA3對完整植株的作用要強于對離體器官或組織的作用。GA3可刺激器官的生長，卻抑制器官的發生，如GA3對不定根的產生具有抑制作用，但在根原基形成以后，則不對不定根的發生造成影響[24]。

鄭啟發等[25]在對龍眼和荔枝的組織培養研究中發現，GA3對兩者的愈傷組織誘導具有抑制作用，應該省去不用。林妃等[26]在對白木香組織培養技術及植株再生的研究中發現，GA3僅對種子萌發具有促進作用，其余誘導器官發生的部分都不宜使用。而在宿靜等[27]對于美國月桂櫻組織培養研究中發現，GA3對芽的伸長沒有效果。據相關報道，赤霉素能促進植物開花，但對于植物離體再生作用較小，尚沒有廣泛運用。

2.2.4 乙烯

乙烯是一種氣態的植物激素，廣泛存在于植物成熟的果實果皮中，對催化果實成熟有促進作用。而乙烯對于植物組織培養作用方面的研究尚少。Kumar[28]和Biddington[29]都對乙烯在愈傷組織誘導、體細胞胚發生、不定芽與不定根的誘導等相關研究進行了概述，表明了乙烯在不同植物品種中具有起到的作用不一，而在木本組織培養中，乙烯的作用很少涉及。謝耀堅[30]在對歐洲云杉胚性愈傷組織培養中乙烯的釋放及其作用的研究中，發現乙烯釋放量的變化對胚性愈傷組織的誘導率無明顯促進或抑制作用。乙烯在木本植物組織培養方面的作用仍需進一步研究。

2.2.5 脫落酸

脫落酸作為五大類激素之一，對植物細胞分裂擴增起著重要調控作用，而且經常在組織培養方面，通過提高愈傷組織的干燥耐受性和防止提早發芽，從而促進體細胞胚的發生與提高體細胞胚的質量。脫落酸不只調節植物細胞的生長發育，還在植物細胞受到脅迫時發揮作用。因此，脫落酸以其在植物生長發育中所起的獨特作用，近年來不斷受到科學家的青睞，研究深度與廣度逐步增加。

Bawis等[31]進行了脫落酸對棕櫚樹體細胞胚發生的影響研究，發現添加0.1 mg/L脫落酸時，促進的體細胞胚發生量最大，濃度過高則會減少體細胞胚的發生量。Alwael等[32]同樣以棕櫚樹為研究對象，發現運用懸浮培養方式，與添加50～100μmol/L的脫落酸濃度對同步化誘導體細胞胚具有促進作用。Fernando等[33]在利用未成熟的椰子種子為外植體，進行愈傷組織誘導后，以添加7.5 μmol/L的脫落酸濃度，體細胞胚發生量最大，但無法進一步萌發出芽，而2.5～5 μmol/L的ABA濃度，可以成功生出芽。

2.3 碳源

在對植物細胞進行組織培養時，除了需要添加植物激素，與基本培養基所提供的基本營養元素外，生長發育主要所需的能量物質是由碳源物質所提供的。碳源一般是糖類物質，常用的碳源物質有蔗糖、葡萄糖、果糖與半乳糖等。其中蔗糖與果糖，在植物組織培養中最為廣泛運用。碳源不只是為植物細胞提供能量物質，還能為植物細胞提供滲透壓，提供細胞吸取養分的動力，而滲透壓與碳源的種類與濃度密切相關。

蔗糖是植物組織培養中，最常用的碳源物質，屬于非還原性二糖。蔗糖在供能外，還能促進愈傷組織的再分化。由于植物細胞對蔗糖的吸收速率較慢，因此蔗糖能夠長期保持較穩定的滲透壓，為植物細胞生長發育提供穩定的環境。而且蔗糖一般不能被微生物直接利用，對微生物的污染有一定程度的減輕效果。

張小蘋[34]利用不同碳源對桑樹莖尖進行培養時，發現果糖是桑樹誘導芽尖與繼代培養效果最佳的碳源，而葡萄糖可在繼代培養中替代果糖，達到更好的培養效果。謝志兵[35]利用不同碳源對獼猴桃的組織培養研究中發現，蔗糖和葡萄糖對芽的分化效應無明顯差異，不過低濃度的碳源不能很好地進行芽分化和生長，而高濃度的碳源雖能較好地誘導芽分化，但抑制了后期芽的生長。在植物組織培養中，一般多用蔗糖作為培養基碳源，對于個別植物的組織培養則以葡萄糖與果糖這些單糖作為碳源更佳。因此，對植物組織培養中碳源種類與濃度的選擇也是必不可少的關鍵環節。

2.4 pH值

pH值在植物組織培養研究中，通常代表著培養基中的酸堿度。大多數植物在離體培養中，pH值的要求5.0～6.2。適宜的pH值，是植物組織離體再生過程中能夠正常吸取生長養分的重要影響因素。并且pH值能夠影響培養基的凝固程度，當pH較低(≤4.0)時，加入一定量的凝固劑，培養基都難于凝固。而培養基的凝固程度對培養物的支撐作用，對其保證正常生長發育具有重要意義。

周再知等[36]在鈣離子與pH值對柚木組培苗生長和礦質養分吸收影響的研究中發現，pH值對苗高生長及愈傷組織生物量積累有顯著影響，適宜pH值為6.0，只有穩定在最適pH值上，增加鈣離子濃度，才會增加柚木組培苗的營養元素吸收。李欣怡等[37]對3個越橘品種組培苗在pH值5～9條件下培養發現，不同越橘品種在相同pH值條件下生長狀況不一致。因此，表明pH值是影響植物組織培養的關鍵因素之一，而且不同植物品種的最適pH值都有所不同。

3 影響木本植物組織培養的突出問題

3.1 外植體滅菌

外植體消毒滅菌，是植物組織培養技術中關鍵的一步。不僅要求對外植體進行徹底滅菌，還要盡可能地減少對外植體細胞的傷害，保證植物細胞仍具有旺盛的生長分化能力[38]。在植物生長過程中，如頂芽、莖和葉等許多植物組織，常年暴露在外界環境中，容易附生或共生多種微生物，并且微生物可侵入組織內部，致使外植體消毒滅菌困難，易造成內生菌污染。由于熱帶、亞熱帶地區常年高溫多雨，空氣濕度大，使得內生菌污染現象更為嚴重。因此，選取含菌較少且生長分化能力較強的植物組織作為外植體，在適宜的滅菌方法下進行外植體消毒滅菌，是建立植物無菌培養離體再生的關鍵。

方慶等[39]對桃的莖段進行升汞、次氯酸鈉和乙醇3種滅菌方法發現，以乙醇加0.2%升汞滅菌9 min的組合效果最佳；馬蘭珍等[40]對不同來源的雜交松外植體采用不同的滅菌方法進行試驗發現，不同環境下的外植體帶菌程度不同，來自于林學院苗圃的外植體在75%酒精與0.1%升汞5～6 min滅菌下效果較好，而來自于東門林場苗圃及林業局種苗基地的外植體以上方法都不理想，可能與其周圍環境的微生物較多有關；岑湘濤等[41]在對杧果莖段離體培養中外植體選擇與滅菌方法進行了探索發現，以室內沙培杧果帶腋芽的莖段在乙醇消毒30s后0.1%升汞滅菌8 min的腋芽萌發率較高。

前人對外植體滅菌大部分采用表面滅菌，常用的滅菌劑有乙醇、次氯酸鈉、升汞與高錳酸鉀等，通常需要將不同滅菌劑進行組合使用，以求達到最佳的滅菌效果。同時要嚴格控制滅菌時間，如升汞在滅菌過程中，時間過短，殺菌不徹底，易導致外植體污染嚴重，而時間過長，則會對組織細胞起到殺傷作用，最終使外植體死亡。因此，應盡量選擇含菌較少，生長能力強的植物組織作為外植體。

3.2 外植體褐化

外植體褐化有兩種形式：一種是酶促褐化，指在植物組織培養過程中，外植體材料由于自身多酚氧化酶作用，將酚類物質氧化成醌類物質，并向培養基中釋放，致使培養基變褐，影響外植體細胞的正常生命代謝活動，毒害整個外植體組織，最終逐漸死亡；另一種是非酶促褐化，常是由于外植體自身細胞受外界環境不利因素影響，造成的細胞壞死，或發生細胞程序性死亡的褐化現象。

王玖瑞等[42]在利用棗幼胚建立離體培養時發現，外植體褐化是棗幼胚離體培養的關鍵問題，而剝去胚珠中的珠被后再進行接種，可有效防止外植體褐化。鄔秀宏等[43]在對茶樹組織培養的外植體褐化現象控制方面進行探索發現，外植體表面消毒以6 min為宜，并且Vc和核黃素對防止茶樹外植體褐化均有良好效果。付鳳玲等[44]在對桑樹莖尖培養的外植體褐化的控制研究中發現，活性炭、聚乙烯吡咯烷酮、Na2S2O3以及用 8-羥基喹啉等抗氧化劑對外植體褐化具有很好的控制作用，不過活性炭對莖葉生長有抑制作用，而聚乙烯吡咯烷酮副作用較小，是理想的抗氧化劑，能添加到培養基和對外植體進行前處理。張小紅等[45]在對核桃離體培養外植體褐化的研究中發現，幼嫩的外植體比半木質化與休眠期的外植體更容易發生褐化，液體培養能夠減輕褐化，植物激素6-BA、IAA與GA也能夠減輕外植體的褐化程度，硫代硫酸鈉對外植體防褐化、提高外植體萌芽率與有效新梢率有促進作用。

3.3 愈傷組織褐化

愈傷組織褐化是植物組織培養繼代過程中普遍存在的現象，表現為從愈傷組織團塊一小部分組織開始褐變發黑，隨后褐化逐漸蔓延整個愈傷組織，致使愈傷組織停止生長分化，直至死亡。將初代培養出生長狀態良好的愈傷組織進行繼代培養，一方面能夠為愈傷組織提供新的培養條件，加快愈傷組織的生長速度，由于褐化主要與組織細胞內多酚氧化酶在氧化酚類物質成醌類物質有關，所以愈傷組織在快速生長的同時，愈傷組織褐化也隨之加快，從而影響植物組織培養后續正常進行[46]。因此，控制愈傷組織褐化是保障許多植物組織培養順利完成的重要步驟。

對于控制愈傷組織褐化現象的研究，前人主要是從抗褐化劑、植物激素、培養方式等方面進行探索。陳劍勇[47]使用維生素C、檸檬酸、半胱氨酸、硫代硫酸鈉 4種抗氧化劑對杉木愈傷組織進行防褐化研究發現，維生素C與半胱氨酸能有效抑制褐化，且對愈傷組織生長沒有明顯的抑制作用。張彥波等[48]在對喜樹愈傷組織抑制褐化的研究中發現，在愈傷組織繼代過程中SH培養基比MS培養基的愈傷組織褐化率要低，并且加入抗壞血酸與活性炭也能有效降低愈傷組織褐化率。唐利球等[49]在對金錢樹愈傷組織繼代中，采用液體培養與使用N6培養基都能夠改善愈傷組織在繼代過程中的褐化現象。張明文等[50]在銀杏組織培養的愈傷組織繼代褐化方面研究發現，培養基中添加不同濃度與種類的糖，造成滲透壓不同，5%蔗糖濃度對防褐化效果最好，并且不同品種的銀杏在愈傷組織繼代過程中，褐化程度不同。

4 結語

木本組織培養技術通過這些年的發展，雖然已經在不少木本植物品種上取得一定的進展，但普遍仍存在體細胞胚誘導困難，組培苗移栽成活率低，難以真正實現優良種苗的高效繁育的問題[51-53]。對于許多木本植物尤其是熱帶作物，因處于高溫高濕的環境下，導致進行組織培養時，內生菌污染嚴重。木本植物的組織培養技術在不同品種上的發展進度嚴重不一致，由此筆者希望通過對不同木本植物品種組織培養技術進行概述，讓組織培養技術發展存在瓶頸的植物品種能夠參考其他相近品種的成功案例，從外植體消毒滅菌、基本培養基的選擇、不同植物激素的配比與培養方法等方面有所突破，完成對優良種苗、珍稀物種、工廠化操作的快速高通量繁育的目標。