春羽炭疽病病原鑒定及生物學(xué)特性研究

余鳳玉，宋薇薇，韓 軒

（中國(guó)熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院椰子研究所，海南 文昌 571339）

【研究意義】春羽（Philodendron bipinnatifidumSchott ex Endl.），又稱春芋，是天南星科喜林芋屬植物。原產(chǎn)于南美洲，20世紀(jì)80年代前后引入廣東，隨后逐漸在華南地區(qū)推廣[1]。春羽喜高溫多濕環(huán)境，耐陰怕強(qiáng)光直射。葉形奇特，葉色濃綠有光澤，四季常青，株型優(yōu)美，具有很高的觀賞價(jià)值，多作為園林觀賞植物種植于公園、路邊等地，也是一種優(yōu)良的室內(nèi)喜陰盆栽觀葉植物，適于布置客廳、臥室、書房，也可用于賓館、飯店、商店等裝飾綠化。春羽還有凈化空氣和水體的作用。據(jù)報(bào)道，春羽和綠寶石喜林芋（Philodendron erubescenscv.green emerald）一起放置室內(nèi)，對(duì)苯、TVOC（總揮發(fā)性有機(jī)物）還有較強(qiáng)的凈化能力，在一定程度上還可以吸收甲醛，適合用于凈化苯、TVOC和甲醛污染[2]。春羽還可以去除污水中的TN（總氮含量）、TP（總磷含量）、CODCr(重鉻酸鹽指數(shù))和（氨氮）等[3-4]。2016年1月，我們?cè)诤Ｄ鲜∥牟幸哟笥^園露地種植的春羽葉片上發(fā)現(xiàn)一種新病害，其癥狀主要表現(xiàn)為初期葉片出現(xiàn)水漬狀病斑，隨后病斑迅速擴(kuò)大，呈不規(guī)則褐色壞死狀，嚴(yán)重者全葉或全株枯死，發(fā)病率達(dá)50 %以上，極大影響春羽的觀賞價(jià)值?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】目前有關(guān)春羽病害的研究報(bào)道尚不多，陳永強(qiáng)等曾報(bào)道廣東中山市橫欄鎮(zhèn)三沙花木基地有70%～80%春羽發(fā)生由菊歐氏桿菌（Erwinia chrysanthemi）引起的細(xì)菌軟腐病[5]；游春平等亦報(bào)道在廣東省廣州、中山和珠海等地的春羽上發(fā)生細(xì)菌性軟腐病，發(fā)病率在10%～20%之間，嚴(yán)重的可達(dá)50%[1]；易潤(rùn)華等在廣東湛江的春羽上發(fā)現(xiàn)一種由芒果新殼梭孢菌〔Neofusicoccum mangiferae（Syd.& P.Syd.）Crous, Slippers & A.J.L.Phillips〕引起的葉斑病[6]。對(duì)春羽炭疽病病原菌的鑒定和生物學(xué)特性方面的研究還未見有報(bào)道。【本研究切入點(diǎn)】為了確定該病害的病原物，為該病害防治明確方向，防止該病害大面積發(fā)生?！緮M解決的關(guān)鍵問題】通過對(duì)海南春羽葉部病樣的采集、組織分離純化培養(yǎng)、致病性測(cè)定，利用傳統(tǒng)的形態(tài)學(xué)鑒定方法并結(jié)合rDNA-ITS測(cè)序分析，對(duì)春羽病葉上的病原菌進(jìn)行鑒定，并對(duì)該菌在不同溫度、pH、碳源和氮源下的菌絲生長(zhǎng)、產(chǎn)孢量變化等生物學(xué)特性進(jìn)行研究，以期為該病害的診斷和防治提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

病原菌：從海南省文昌市椰子大觀園露地栽培的春羽葉片中分離獲得。

PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、瓊脂粉20 g、蒸餾水1 000 mL；Czapek培養(yǎng)基：硝酸鈉 2.00 g、磷酸氫二鉀1.00 g、氯化鉀0.50 g、七水硫酸鎂0.50 g、硫酸鐵0.01 g、蔗糖30.00 g、瓊脂粉18 g、蒸餾水1 000 mL。

1.2 病原菌分離

采用常規(guī)的組織分離法[7]分離病原菌。將春羽葉片病健交界處組織剪成約0.5 cm×0.5 cm的正方形小塊，依次經(jīng)75 %乙醇和0.1 %升汞消毒，再用無菌水洗滌3次后，放在滅菌后的空培養(yǎng)皿中晾干多余水分，接入PDA培養(yǎng)基平板上，每皿5塊，置于25 ℃培養(yǎng)箱中避光培養(yǎng)4 d，挑取菌落邊緣菌絲移至新PDA平板上置于相同條件下純化，所得純化菌株編號(hào)，置于4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 致病性測(cè)定

對(duì)分離到的菌株采用離體葉片接種法進(jìn)行致病性測(cè)定。選取生長(zhǎng)一致健康的離體葉片，滅菌水沖洗后用吸水紙吸干，置于濾紙保濕的培養(yǎng)皿內(nèi)，用注射器針頭在葉片上造成直徑約5 mm大小的傷口備用。將在25 ℃ PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)7 d的菌株用打孔器制成直徑5 mm的菌塊，把菌塊貼在葉片傷口處，以貼無菌塊PDA培養(yǎng)基作對(duì)照，每個(gè)處理3次重復(fù)。25 ℃培養(yǎng)，觀察發(fā)病情況。根據(jù)柯赫氏法則，再次對(duì)接種發(fā)病的春羽葉片進(jìn)行病原菌的分離鑒定。

1.4 病原菌鑒定

形態(tài)學(xué)鑒定：將菌株在PDA培養(yǎng)基上25 ℃恒溫培養(yǎng)7 d后，觀察菌落形態(tài)、大小，同時(shí)無菌水制成孢子懸浮液，在電子顯微鏡下觀察病原菌的分生孢子及附著孢形態(tài)。

分子生物學(xué)鑒定：使用植物基因組DNA提取試劑盒〔購(gòu)于天根生化科技（北京）有限公司〕提取病原菌基因組DNA。參照White等[8]設(shè)計(jì)的真菌rDNA-ITS通用引物（ITS1、ITS4）對(duì)病原菌進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物由生工生物工程（上海）股份有限公司測(cè)序，測(cè)序結(jié)果與GenBank相關(guān)數(shù)據(jù)進(jìn)行同源性分析，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹（DNAMAN）。

1.5 病原菌生物學(xué)特性測(cè)定

1.5.1 不同溫度、pH對(duì)病原菌菌絲生長(zhǎng)和產(chǎn)孢量的影響 將在PDA培養(yǎng)基上25 ℃培養(yǎng)7 d的病原菌，用直徑為5 mm的打孔器打取菌塊備用。設(shè) 5、10 、15 、20 、25、30 、35 、40 ℃共 8 個(gè)溫度梯度，pH為5、6、7、8、9、10、11共7個(gè)處理。將菌餅接入到供試PDA培養(yǎng)基平板（90 mm）上恒溫培養(yǎng)，每個(gè)處理6次重復(fù)。培養(yǎng)7 d后采用十字交叉法測(cè)量菌落直徑，用血球計(jì)數(shù)板法測(cè)定產(chǎn)孢量。

1.5.2 不同碳、氮源對(duì)菌絲生長(zhǎng)的影響 以Czapek培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基。其將蔗糖分別用等量的葡萄糖、乳糖、阿拉伯樹膠粉、甘油、甘露醇和可溶性淀粉替代，制成不同碳源的培養(yǎng)基，以無碳源培養(yǎng)基為對(duì)照；用等量的硝酸銨、硝酸鉀、硫酸銨、磷酸氫二銨和蛋白胨分別替換Czapek培養(yǎng)基的硝酸鈉，制成不同氮源的培養(yǎng)基，以無氮源培養(yǎng)基為對(duì)照。25 ℃恒溫培養(yǎng)，每個(gè)處理6次重復(fù)。培養(yǎng)7 d后測(cè)量菌落直徑并觀察菌落生長(zhǎng)情況。

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SAS軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，采用Duncan氏新復(fù)極差法進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 致病性測(cè)定結(jié)果

以采用組織分離化從春羽病樣標(biāo)本中獲得的代表性菌株C12進(jìn)行人工接種，刺傷接種的葉片于接種7 d后組織壞死，其表現(xiàn)癥狀與自然發(fā)病癥狀基本相似（圖1）。從發(fā)病的葉片組織中可分離出相同的病原菌，而對(duì)照和無刺傷接種增多無癥狀表現(xiàn)。表明從發(fā)病春羽葉片中分離獲得的病原菌是導(dǎo)致春羽炭疽病的病原菌，傷口是病原菌侵入的主要途徑。

圖1 春羽炭疽病發(fā)病癥狀Fig.1 Symptoms of Philodendron bipinnatifidum anthracnose

2.2 病原菌形態(tài)特征

春羽炭疽病菌C12在PDA平板上培養(yǎng)7 d后，菌落為圓形，邊緣整齊，毛絨狀，菌絲初期為白色，隨著菌齡增加，顏色逐漸轉(zhuǎn)為青灰色，產(chǎn)生紅色孢子堆（圖2A）。分生孢子橢圓形，兩端鈍圓，單胞，無色，大小為 6.14～14.69 μm × 2.96～6.49 μm（圖2B）。附著胞褐色，邊緣瓣?duì)罨蛘R，大小為 11.77 ～ 19.06 μm × 5.34 ～ 7.67 μm（圖 2C）。

根據(jù)病原菌的培養(yǎng)性狀和形態(tài)特征，將海南春羽炭疽病病原初步鑒定為炭疽菌屬真菌。

圖2 菌株C12在PDA培養(yǎng)基上的培養(yǎng)性狀和形態(tài)特征Fig.2 Cultural characteristics and morphological characteristics of C12 strain on PDA medium

2.3 分子生物鑒定

利用真菌鑒定通用引物ITS1和ITS4對(duì)菌株C12的基因組DNA進(jìn)行擴(kuò)增并測(cè)序。測(cè)序結(jié)果表明，供試菌株C12的DNA片斷長(zhǎng)度為533 bp。將測(cè)序獲得的序列提交至GenBank進(jìn)行比對(duì)，BLAST分析結(jié)果表明，菌株C12與GenBank中收錄的膠孢炭疽菌Colletotrichum gloeosporioides（KP900256、KP900283）同源性達(dá)99%以上。系統(tǒng)發(fā)育樹顯示，菌株C12與親緣關(guān)系最近的4株膠孢炭疽菌C.gloeosporioides處于同一分支，支持率達(dá)100 %，與炭疽菌屬內(nèi)其他真菌的遺傳關(guān)系較遠(yuǎn)（圖3）。

圖3 基于ITS序列以N-J法構(gòu)建的炭疽菌系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 The N-J phylogenic tree of Colletotrichum based on the sequences of ITS

2.4 春羽炭疽病菌生物學(xué)特性

2.4.1 不同溫度對(duì)病原菌菌絲生長(zhǎng)和產(chǎn)孢量的影響 不同溫度對(duì)菌絲生長(zhǎng)和產(chǎn)孢量影響顯著（表1）。菌絲在5～40 ℃條件下均能生長(zhǎng)，25℃時(shí)生長(zhǎng)最快，其次為30 ℃，低于15 ℃時(shí)菌絲生長(zhǎng)緩慢。30 ℃時(shí)產(chǎn)孢量最大，為56.50×106個(gè)/皿，其次為25 ℃，溫度低于15 ℃或高于35 ℃均不產(chǎn)孢。因此，春羽炭疽病菌生長(zhǎng)和產(chǎn)孢的適宜溫度為 25～30 ℃。

表1 不同溫度對(duì)菌株C12的菌落直徑和孢子量的影響Table 1 Effects of different temperatures on colony diameter and spore production of C12 strain

2.4.2 pH值對(duì)病原菌菌絲生長(zhǎng)和產(chǎn)孢的影響 從表2可以看出，春羽炭疽病菌在pH值5～11內(nèi)均可很好地生長(zhǎng)，堿性條件比酸性條件稍好一些，其中pH值為8～9時(shí)菌絲生長(zhǎng)最快，差異不顯著，pH值對(duì)產(chǎn)孢影響差異顯著，pH值為9時(shí)產(chǎn)孢量最大，達(dá)到23.25×106個(gè)/皿。

2.4.3 不同碳、氮源對(duì)病原菌菌絲生長(zhǎng)的影響 春羽炭疽菌在有碳和無碳培養(yǎng)基上均能生長(zhǎng)（表3）。最適宜菌絲生長(zhǎng)的碳源為蔗糖，培養(yǎng)7 d菌落直徑可達(dá)80.50 mm，其次為阿拉伯樹膠粉、可溶性淀粉，與對(duì)照（無碳）相比，乳糖明顯抑制了菌絲的生長(zhǎng)。最適宜菌絲生長(zhǎng)氮源為硝酸鈉，其次為蛋白胨，硝酸銨和硫酸銨極顯著抑制了菌絲生長(zhǎng)。

表2 不同pH對(duì)對(duì)菌株C12的菌落直徑和孢子量的影響Table 2 Effects of different pH on colony diameter and spore production of C12 strain

表3 不同碳源和氮源對(duì)菌株C12的菌落直徑的影響Table 3 Effects of different carbon and nitrogen sources on colony diameter of C12 strain

3 討論

膠胞炭疽菌是一類經(jīng)濟(jì)重要病原真菌，寄主繁多，有2200多種植物，分布范圍極其廣泛，能夠適應(yīng)大部分作物栽培地區(qū)的氣候環(huán)境，引起炭疽病，給農(nóng)業(yè)生產(chǎn)造成了重大經(jīng)濟(jì)損失[9]。本研究根據(jù)柯赫氏法則、形態(tài)特征、培養(yǎng)性狀，并結(jié)合分子生物學(xué)鑒定的結(jié)果，明確海南春羽的病原菌為膠胞炭疽菌[9，10-15]。春羽炭疽病研究目前未見有報(bào)道。膠孢炭疽菌的菌絲體和分生孢子盤主要在病殘?bào)w上越冬，翌年春天，菌絲體和分生孢子盤產(chǎn)生分生孢子，借助風(fēng)雨和昆蟲傳播到植株上形成初侵染源，條件適宜可發(fā)生多次再侵染，引起病害流行。為了便于病害的流行預(yù)測(cè)和防治，我們進(jìn)一步研究了該病原菌的生物學(xué)特性，結(jié)果顯示，膠孢炭疽菌C12菌株生長(zhǎng)最適溫度25℃，產(chǎn)孢最適溫度30 ℃，喜中溫環(huán)境，與韓長(zhǎng)志報(bào)道的膠孢炭疽菌的最適溫度范圍相符[16]，高于35 ℃時(shí)，不產(chǎn)孢，菌絲生長(zhǎng)受到嚴(yán)重抑制，與楊麗芬等對(duì)云南墨蘭炭疽病菌生物學(xué)特性的研究結(jié)果存在明顯差異[10]。分離自兜蘭的膠孢炭疽菌在以乳糖為碳源時(shí)，對(duì)菌絲生長(zhǎng)起抑制作用[14，17]，與本研究結(jié)果一致。但胡永亮等[18]的研究表明乳糖對(duì)引起鐵皮石斛的膠孢炭疽菌菌絲生長(zhǎng)有促進(jìn)作用，符齋等[19]也研究發(fā)現(xiàn)乳糖能促進(jìn)杧果炭疽病膠孢炭疽菌菌絲生長(zhǎng)；而對(duì)引起百合炭疽病和麥冬炭疽病的膠孢炭疽菌的菌絲生長(zhǎng)影響不顯著[20-21]。引起這些差異的原因可能是膠孢炭疽菌適應(yīng)生存環(huán)境的結(jié)果，但具體原因尚需進(jìn)一步研究。本研究結(jié)果表明，硝酸銨和硫酸銨明顯抑制了春羽膠孢炭疽菌菌絲的生長(zhǎng)，與石斛膠孢炭疽菌、菩提樹膠孢炭疽菌的研究結(jié)果一致[18，22]，而硝酸銨對(duì)建蘭膠孢炭疽菌、兜蘭膠孢炭疽菌的病原菌絲生長(zhǎng)都有促進(jìn)作用[14，23]，與本研究結(jié)果相反。以上研究表明，膠孢炭疽菌的生物學(xué)特性隨寄主、地域的不同而不同，可能是膠孢炭疽菌在不同寄主和區(qū)域中具有不同的生態(tài)適應(yīng)性，具體原因也需要進(jìn)一步研究。本研究只探討了溫度、pH、碳源和氮源對(duì)膠炭疽菌菌絲生長(zhǎng)和產(chǎn)孢量?jī)蓚€(gè)指標(biāo)的影響，具有一定的局限性，下一步工作應(yīng)對(duì)孢子萌發(fā)條件、致死溫度、濕度對(duì)病原菌的影響等方面開展研究，以期為春羽炭疽病的預(yù)測(cè)和防治提供更多理論依據(jù)。

4 結(jié)論

引起海南文昌大觀園春羽炭疽病的病原菌為膠孢炭疽菌（C.gloeosporioides）。春羽炭疽病菌C12菌絲生長(zhǎng)的最適溫度為25 ℃，產(chǎn)孢最適溫度為30 ℃，溫度低于20 ℃或高于30 ℃均不產(chǎn)孢。菌絲生長(zhǎng)最適pH是8～9，最適產(chǎn)孢pH值為9。供試的碳源中最利于病原菌菌絲生長(zhǎng)的碳源為蔗糖，乳糖抑制菌絲生長(zhǎng)；最適合病原菌菌絲生長(zhǎng)的氮源為硝酸鈉，硝酸銨和硫酸銨抑制菌絲生長(zhǎng)。根據(jù)春羽膠孢炭疽菌的生物學(xué)特性，對(duì)春羽炭疽病除了常規(guī)的藥劑防治外，還可通過水肥管理等農(nóng)業(yè)措施來抑制病原菌的生長(zhǎng)和產(chǎn)孢，降低侵染源，防止該菌在有利的環(huán)境條件下暴發(fā)流行。