黑水虻蟲卵冷藏保存技術研究

王鳳英 ，肖乾鵬，王 星

（1.廣州安芮潔環保科技有限公司，廣東 廣州 510450；2.湖南農業大學植物保護學院，湖南 長沙 410128）

【研究意義】黑水虻Hermetia illucensL.隸屬雙翅目Diptera水虻科Stratiomyidae扁角水虻屬Hermetia，又名亮斑扁角水虻。可通過取食有機廢棄物產出新型動物飼料及有機肥，是當前研究較多的一種資源昆蟲[1-5]。國內外學者對黑水虻幼蟲和成蟲的生物學特性進行了較多研究[6-8]，但關于冷藏黑水虻蟲卵的報道甚少。【前人研究進展】Holmes等對蟲卵孵化的發育起始溫度進行研究，認為黑水虻卵發育的起始溫度在 12～16 ℃[9]。Shaphan等在研究溫度和飲食對黑水虻生長發育的影響中發現：10 ℃時，蟲卵無法孵化；15 ℃冷藏14 d，蟲卵孵化率為10.6%（±2.1）%；20 ℃冷藏8 d，孵化率為59%（±10.6）%，冷藏效果不理想[10]。【本研究切入點】我們認為蟲卵冷藏后無法順利孵化的原因有以下幾點：一是冷藏溫度低于蟲卵發育起始溫度，同時未采用正確手段使蟲卵休眠或滯育，蟲卵死亡；二是冷藏過程中濕度不適宜，低溫環境中，空氣中水分低，蟲卵易脫水死亡，而濕度過高時，水汽在蟲卵表面凝結，蟲卵死亡；三是蟲卵儲存的營養物質在冷藏過程中消耗過快，無法支撐蟲卵正常孵化；四是基于Mazur提出低溫對卵的傷害隨卵的發育而減輕的觀點[11]，推測不同發育階段的蟲卵對低溫的耐受性不同。【擬解決的關鍵問題】綜合以上4點考慮，為提高冷藏蟲卵的孵化率，本試驗將黑水虻卵發育劃分為卵裂期、胚盤胚帶形成期、原腸形成期、胚體分節期、破殼期（因體壁形成期與器官形成期發育時間交叉，故本研究統一為破殼期）5個時期，并將5個發育時期的蟲卵分別在溫度為12 ℃、濕度為80%環境中進行冷藏。姬越等研究了黑水虻發育的適宜溫度，認為黑水虻孵化的最佳溫度為32℃，此溫度下孵化歷期最短、初孵幼蟲最多[8]。參照其研究結論，本實驗將冷藏過后的蟲卵轉置于32 ℃的環境中孵化，以蟲卵孵化80%為基準線驗證發育階段對蟲卵冷藏后孵化率及幼蟲生長發育的影響，以期為黑水虻規模化生產苗種培育環節提供理論基礎和技術支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 供試蟲卵 黑水虻蟲卵由廣州安芮潔環保科技有限公司提供。幼蟲取食餐廚垃圾，飼養溫度為30（±2） ℃。成蟲飼養溫度為28 （±3）℃，相對濕度為50%～90%，自然光照。待成蟲交配，采集集卵板上的初產卵塊，卵塊的產卵間期不超過2 h。試驗于2018年6月至2019年3月在廣州安芮潔環保科技有限公司實驗室進行。

1.1.2 幼蟲飼料 初孵幼蟲取食含水量70%的麩皮，5～15日齡幼蟲取食含水量75%的餐廚漿料。幼蟲飼料及試養方法由廣州安芮潔環保科技有限公司提供。

1.2 試驗方法

1.2.1 黑水虻蟲卵胚胎發育期 參照莫文艷等的方法，單克初產蟲卵采用41 000個卵粒進行養殖參數計算。黑水虻蟲卵在32 ℃氣候箱（寧波賽福實驗儀器有限公司，PRX-350B）發育8.5 h形成“瓶”狀的胚帶，發育13 h為原腸形成期，發育30 h體壁開始背合，48 h后為破殼期。

1.2.2 蟲卵冷藏與孵化 收集產卵時間相差不超過2 h的蟲卵9 g，用分析天平稱量18份0.5 g的樣品平鋪（鋪放厚度不高于3 mm）在小培養皿內，試驗設冷藏初產蟲卵、冷藏胚盤胚帶形成期蟲卵、冷藏原腸期蟲卵、冷藏體壁背合期蟲卵、冷藏破殼期蟲卵、32℃直接孵化的初產蟲卵（對照）6個處理，分別記為A、B、C、D、E、CK，每個處理3次重復。除處理A外，其余處理均置于孵化氣候箱（32℃，RH 80%，光周期14L∶10D）保存。隨后立即對處理A進行鏡檢，記錄蟲卵發育階段和存活率后放置到冷藏氣候箱。隔6 h，從孵化氣候箱取出處理B鏡檢；隔13 h取出處理C鏡檢；隔30 h取出處理D鏡檢；隔40 h取出處理E鏡檢，各自鏡檢完畢后均放置到12℃冷藏氣候箱保存。對照一直置于32℃的孵化氣候箱，直至自然孵化。對放進冷藏氣候箱冷藏的各處理，每隔24 h，隨機取樣置于載玻片上，每個載玻片上100個蟲卵，3次重復，將載玻片放入孵化氣候箱進行孵化，每天鏡檢發育情況，利用顯微鏡計數未孵化卵數（D），計算孵化率（S），直至孵化率低于80%。

1.2.3 原腸期卵冷藏處理及初孵幼蟲總重測定 在12個直徑為10 cm的孔徑0.180 mm分級篩上分別稱量1 g初產蟲卵置于孵化氣候箱，發育到原腸期后轉移到冷藏氣候箱分別冷藏0、5、10、15 d（4個處理，每個處理3次重復），而后轉移回到孵化氣候箱。將分級篩放在直徑為15 cm的培養皿內，培養皿內部四周邊緣均勻撒3 g玉米粉。待幼蟲孵化后，稱量初孵幼蟲和玉米粉的總質量，計算初孵幼蟲質量。然后將初孵幼蟲和玉米粉一起撒到250 g含水量70%的麩皮上方（麩皮厚度約10 cm，置于容器中部，容器為40 cm×60 cm×10 cm的塑料盒），并用勺子輕輕撥開初孵幼蟲，避免玉米粉結球發粘導致幼蟲死亡。

1.2.4 不同冷藏時間原腸期卵5日齡幼蟲存活率 養殖5 d，幼蟲取食完開口料后，利用幼蟲避光的習性，將堆積在幼蟲表面的麩皮殘渣輕輕抹去，直至只剩幼蟲。然后將麩皮殘渣放在孔徑0.250 mm篩網上，篩網放在陽光下，讓殘渣內殘留的極少量幼蟲掉落到篩網下方的培養皿內。將收集到的幼蟲稱量總重，隨機取樣3個，用分析天平稱量并記錄重量（每個樣品重量約0.1 g），計數幼蟲數量，計算5日齡幼蟲存活率：

1.2.5 冷藏5、10、15 d原腸期卵15日齡幼蟲存活率和幼蟲重量 初孵幼蟲在麩皮中取食5 d將幼蟲輕輕篩出并轉移到1 kg含水量70%的餐廚漿料（漿料厚度約3 cm，置于容器中部，容器為50 cm×50 cm×15 cm的面包框內裝著0.180 mm孔徑的紗網網兜）上飼養。漿料視取食情況進行補料，當新鮮漿料都變成灰褐色時再補1 kg，養殖過程中，各處理合計投喂漿料16 kg。幼蟲13日齡時停止補料進行饑餓處理，幼蟲15日齡時用孔徑0.425 mm篩將幼蟲與殘渣分離，稱量總重后，隨機取 100 頭進行稱重，計算單頭幼蟲平均體重（稱量后放回飼養盒）。計算幼蟲養殖存活率：

試驗數據采用LSD多重比較進行方差分析，采用Excel繪圖。

2 結果與分析

2.1 冷藏時間對不同發育階段黑水虻蟲卵孵化率的影響

從圖1可以看出，冷藏時間對不同發育階段黑水虻蟲卵孵化率具有顯著影響，初產蟲卵（處理A）不能直接冷藏，冷藏1 d死亡率達100%。破殼期卵（處理E）不適于冷藏，冷藏3 d后幼蟲無法破殼。原腸期卵（處理C）孵化率＞80%的冷藏周期為15 d，顯著大于體壁背合期卵（處理D）的6 d和胚盤胚帶形成期卵（處理B）的13 d，故原腸期卵是較適合的冷藏階段。

圖1 冷藏時間對不同發育階段黑水虻蟲卵孵化率的影響Fig.1 Effects of cold storage time on hatching rate of Hermetia illucens at different developmental stages

2.2 原腸期蟲卵不同冷藏時間對黑水虻生長發育的影響

2.2.1 原腸期不同冷藏時間對黑水虻不同時期幼蟲生長發育的影響 隨著冷藏時間拉長，部分初孵幼蟲由于活力不足，無法順利從紗網掉落到盆內。稱量初孵幼蟲質量可以從側面反映蟲卵的有效孵化率。冷藏15 d卵的初孵幼蟲質量顯著低于對照（P=2.82e-6），詳見表1。

2.2.2 原腸期不同冷藏時間對黑水虻5日齡幼蟲生長發育的影響 各處理初孵幼蟲養殖5 d后，篩分稱量總重、百頭重，計算冷藏0、5、10、15 d卵的5日齡幼蟲存活率。結果（表1）顯示各處理5日齡幼蟲百頭重無顯著差異（P=0.434），冷藏15 d的5日齡幼蟲存活率顯著低于對照（P=6.1e-7）。

2.2.3 原腸期不同冷藏時間對黑水虻15日齡幼蟲生長發育的影響 將各處理收獲的5日齡幼蟲繼續養殖10 d后，篩分稱量總重、百頭重，計算15日齡幼蟲養殖存活率（此處的養殖存活率以5日齡幼蟲數為基數而非蟲卵數），結果（表1）顯示各處理15日齡幼蟲百頭重無顯著差異（P=0.187），冷藏15 d的15日齡幼蟲存活率顯著低于對照（P=0.024）。

表1 冷藏時間對黑水虻不同階段幼蟲生長發育的影響Table 1 Effects of cold storage time on growth and development of Hermetia illucens larvae at different developmental stages

3 討論

黑水虻卵冷藏過程中，初產蟲卵無法發育直接死亡，可能是因為初產蟲卵的發育起始溫度高于12 ℃。Holmes等研究認為黑水虻卵發育的起始溫度在12～16 ℃[9]，然而其研究報道中未說明蟲卵進入冷藏階段時的發育情況，故我們推測初產蟲卵的發育起始溫度高于12 ℃。

黑水虻其他幾個發育階段的蟲卵經12 ℃冷藏后，均能在32 ℃發育成幼蟲。但隨著冷藏時間推移，幼蟲無法正常破殼，死于卵殼內。我們在研究黑水虻卵胚胎發育時發現，未經冷藏的蟲卵表面有一層粘液，正常發育的胚胎出殼前尾部會分泌一種疑似具有溶解卵殼功能的液體，幼蟲通過蠕動身體把部分液體擠到頭頂，利用口器持續頂頭頂卵殼，直到出現裂縫，幼蟲從卵殼中爬出。而冷藏過后的蟲卵，表面粘液消失，在孵化時，未見尾部分泌液體，可能是黑水虻卵冷藏過程中失水所致。

黑水虻卵是一個大細胞，最外層為卵殼，卵殼下方為卵黃膜。卵殼或卵殼與卵黃膜間形成蠟質層，卵殼與蠟質層起到保護卵、防止卵內水分過量蒸發和阻止水溶性物質自由進出的卵的作用[12]。我們曾在空氣濕度約50%，通風優良的環境中孵化蟲卵，發現孵化率極低，蟲卵死亡狀態與蟲卵冷藏時的死亡狀態類似，懷疑蟲卵冷藏過程中，卵殼或蠟質層受損，卵內水分大量蒸發，導致幼蟲無法正常破殼。我們后續加大冷藏濕度（90%）進行試驗，冷藏效果不理想，蟲卵表面易著落凝結的水珠，卵孵化率低。推想如果要進一步增加蟲卵冷藏間期，需要從蟲卵保濕以及種蟲養殖繁育時補充營養等方面著手。

蟲卵冷藏對幼蟲的發育造成一定的影響，隨著冷藏時間增長，孵化歷期加長，初孵幼蟲活力變差甚至無法破殼，這使得后期養殖過程中，經冷藏處理的幼蟲發育相對對照不整齊，這個現象在冷藏15 d時非常明顯。發育不整齊的幼蟲不適宜養殖為蛹用于繁育，故本實驗未繼續作成蟲繁育方面的研究，如果冷藏技術有新進展，不再影響幼蟲發育的整齊度，有待進行冷藏卵的成蟲繁育方面研究。

從原腸期卵分別冷藏0、5、10、15 d對黑水虻生長發育的影響結果中可以看出，各處理均存在蟲卵孵化率高、初孵幼蟲（1～5日齡）存活率低和幼蟲（5～15日齡）養殖存活率高的規律，與姬越等的報道相似[8]。在試驗過程中發現，孵化環境溫濕度、蟲卵鋪放厚度、飼料表面明水量、飼料透氣性等因素都對初孵幼蟲存活率具有較大影響，更全面的了解初孵幼蟲存活率的影響因素，提升初孵幼蟲存活率是黑水虻規模化養殖關鍵技術的研究重點之一。

4 結論

在溫度為12 ℃、濕度為80 %的冷藏環境，經冷藏后的初產蟲卵、體壁背合期和破殼期蟲卵發育受阻，孵化率降低；胚盤胚帶形成期蟲卵冷藏13 d內孵化率＞80%；原腸期的黑水虻卵冷藏15 d內能保持＞80%的孵化率，孵化出來的幼蟲生長發育正常，冷藏超過15 d，孵化率顯著降低，無法正常破殼。所以不同發育階段的蟲卵對低溫的耐受性不同，低溫對卵的傷害會隨卵的發育而減輕，冷藏即將發育完全或已經發育完全的胚胎，胚胎無法正常破殼。