肺纖維化風險預測的臨床生物化學模型

冷 冬 李桂芹 王 穎 繆 冉 陳 鐸 黃驍舾*

(1.首都醫科大學附屬北京朝陽醫院檢驗科， 北京 100020；2．首都醫科大學附屬北京朝陽醫院疾病預防控制處， 北京 100020；3. 首都醫科大學附屬北京朝陽醫院醫學研究中心， 北京 100020；4. 首都醫科大學附屬北京朝陽醫院呼吸與危重癥醫學科， 北京 100020)

肺纖維化(pulmonary fibrosis，PF)是一類相對罕見的致死間質性肺疾病。這類疾病的臨床表現主要包括呼吸急促、肺功能受限、肺損傷以及X線胸片上廣泛的陰影等[1]。大約三分之一的間質性肺疾病與環境和工作因素相關，如吸煙和粉塵或特殊化學品的吸入，其余三分之二的病因尚不清楚[2]。尋找有效的預測指標顯得尤為關鍵和緊迫。

能夠預測 PF 風險的指標包括血清生物標志物、肺功能及影像學特征。代表性的標志物包括表面活性蛋白A和D，肺泡細胞表面抗原KL6和乳酸脫氫酶[2]。這些標志物在間質性肺疾病患者血中的含量上升，由于可重復性差、偏倚以及特異性不高等問題它們很難作為有效的生物標志物。乳酸脫氫酶(lactic dehydrogenase，LDH)是一種常用的臨床生物化學檢測指標，它是一種分泌到細胞外的胞質蛋白酶類，可以用來提示因損傷、細菌毒素暴露以及饑餓引起的細胞死亡，因此也常被用于監測肺損傷和炎性反應。α-羥丁酸脫氫酶(α-hydroxybutyric dehydrogenase，HBDH)是存在于心臟的LDH的同工酶，曾被報道[3]可以用于提示肺部炎性反應。對血漿中LDH、HBDH、白介素-8的含量及白介素-6/白介素-10比值的聯合檢測可以用于肺孢子菌肺炎艾滋病患者的死亡風險評估。盡管目前采用單獨檢測血清中LDH或者其同工酶很難有效預測間質性肺疾病，但聯合檢測LDH和其他血清生物化學指標，將會對從血清學角度預測肺纖維化產生積極影響。

臨床血清生物化學檢測可為呼吸系統疾病的診斷提供有關代謝相關的一般信息[4]。與基因表達數據相類似，生物化學檢測數據也具有高維度特點，并可以進行數據挖掘分析。基因芯片數據分析已經在呼吸系統疾病的研究中成功應用，但目前還沒有對臨床生物化學檢測數據進行挖掘分析的報道。本研究收集PF患者和健康對照組的血清生物化學檢測數據，采用數據挖掘的方法進行數據建模分析。研究結果將為PF的早期診斷提供有益線索。

1 資料與方法

1.1 肺纖維化及對照組血清生化數據選取

從首都醫科大學附屬北京朝陽醫院檢驗科臨床實驗室報告系統搜集到臨床診斷為肺纖維化的患者生物化學檢測結果29份(患者年齡39～92歲)和健康對照組生物化學檢測結果55份(患者年齡50～87歲)。PF的臨床診斷符合美國胸科學會診斷標準[5]，其中包括特發性肺纖維化、結締組織病相關PF、風濕類疾病相關PF、干燥綜合征相關PF、血管炎相關PF和PF類病例。由于樣本數量限制，本研究僅將各類PF病例作為一大類樣本與健康對照進行比較分析。首都醫科大學附屬北京朝陽醫院醫學倫理委員會通過了關于采集患者檢查結果用于臨床研究的申請(2017-Science-10)。

1.2 數據準備與預處理

所有血清樣本均檢測34個常用的生物化學指標，采用Z-計分指數化方法將數據進行歸一化處理，該方法已被成功用于基因芯片數據分析。在數據歸一化處理過程中，各變量與該指標的算術平均數的差值與標準差的比值被作為該樣本歸一化處理后的數據。與原始數據相比，數據經過歸一化處理后轉變為無量綱化數據，變量中位數處于同一水平，這使得樣本間各檢測指標可進行直接比較。處理后的數據加上一個最小正整數可使所有數據為非負數，再將轉變后的數據可以通過Log2轉換，使數據趨于正態分布并使隨機變量趨于恒定，方便圖形展示。

1.3 主成分分析與貝葉斯回歸分析

PF與對照組樣本的生物化學檢測數據是一組高維度數據，每一個生物化學檢測指標與其他檢測指標可能存在一定的聯系。主成分分析可以對數據進行降維處理，可計算出用于鑒別PF與對照組樣本數據的主成分。同時也可計算出檢測指標在主成分上的荷載。貝葉斯回歸分析可進一步分析各主成分的顯著程度。本研究采用Students’ttest(美國微軟 http://products.office.com/)分析PF與對照組樣本間的差異有統計學意義生物化學指標(P<0.05)，累計貢獻率>80%的主成分被定義為可描述肺纖維化與對照組樣本分類的主成分，而樣本分類中的差異有統計學意義主成分可通過貝葉斯回歸分析進行判定(P<0.05)。荷載系數大于0.6的生物化學指標被定義為PF特征性生物化學檢測指標。本研究中的數據分析是采用在R語言3.2.3環境下的pr和arm數據包完成的(http://www/r-project.org/，http://www.bioconductor.org/)[6]。PF特征性生物化學指標的鑒別效果通過雙向聚類分析軟件Cluster3.0(http://bonsai.hgc.jp/～mdehoon/software/cluster/software.htm)和Java Treeview(http://jtreeview.sourceforget.net)進行展示，該軟件是基于歐氏距離相似性度量與完全連鎖算法運行的。

1.4 判別分析與受試者操作特征分析

為了驗證特征性生物化學指標的判別能力，本研究采用貝葉斯判別方法對數據進行深入分析。本研究中的特征性生物化學指標被用于構建樣本類型鑒別方程，采用SPSS 20.0軟件構建具有特殊鑒別系數的PF與對照組樣本類型函數。隨機的血清樣本可根據該方程來判斷傾向于PF或者傾向于非PF健康對照類樣本屬性。如果血清樣本的PF方程函數值高于其健康對照函數值，則判定該血清樣本的患者屬于PF血清生物化學判別高風險人群。本研究同時進行受試者操作特征(receiver operating characteristic，ROC)曲線分析，判斷PF特征性生物化學指標的敏感度與特異度。具有較大ROC曲線下面積的生物化學指標被認定為更有效的PF診斷指標。

1.5 統計學方法

采用Students’ttest方法(微軟Excel軟件)對PF病例組和正常對照組生物化學檢驗數據進行差異分析，P<0.05的生物化學檢測指標為差異有統計學意義指標。采用主成分分析和貝葉斯回歸分析的方法(R命令，R3.2.3版本軟件)提取可顯著區分PF病例組和正常對照組樣本的主成分，P<0.05的主成分為顯著主成分，荷載系數>0.6的生物化學指標為特征性生物化學指標。采用SPSS 20.0軟件進行ROC分析，具有較大ROC曲線下面積的生物化學指標被認定為更有效的PF診斷指標，計算其敏感度與特異度。

2 結果

2.1 生物化學檢測數據的整合和特征性生物化學指標

從臨床報告系統中搜集到臨床診斷為PF與正常對照組的生物化學檢驗報告，正常對照組樣本的各生物化學檢測值均不超出報告參考區間。整合后的數據經過對數轉換，數據中各檢驗指標的中位數差異從0～300放縮到2.0～2.5(表1)。各樣本生物化學檢測數據可以直接比較。經過Students’ttest分析，PF與正常對照組樣本比較，34個常用的生物化學指標中有12個差異有統計學意義(P<0.05)(表2)。

表1 臨床生物化學檢測數據歸一化處理前、后中位數Tab. 1 Median of clinical biochemistry test data before and after normalization

表2 肺纖維化與正常對照間特征性生物化學指標Tab.2 Serum biochemistry parameters differing between patients with PF and healthy controls

2.2 數據降維與特征參數選取

經過主成分分析結合貝葉斯回歸分析，在有12個特征性生化指標的數據中，前7個主成分的累計貢獻率>80%，其中顯著主成分包括PC1(P<0.001)，PC2(P<0.01)和PC5(P<0.05)。PF患者血清樣本與正常對照組血清樣本可以在以這3個差異有統計學意義的主成分為坐標的圖中明顯區分開(圖1)。

圖1 各樣本在3個顯著主成分上的定位Fig.1 Locations of samples on the three significantly altered principle components

12個特征性生物化學指標在3個顯著主成分上的荷載系數見表3。其中有6個特征性生物化學指標在PC1上的荷載系數的絕對值>0.6，分別為荷載系數為正的白蛋白 (albumin，ALB)，鈣 (calcium，Ca)，前白蛋白 (pre-albumin，PAB)，白蛋白與球蛋白之比(albumin to globulin ratio，A∶G)，其中荷載系數為負的有HBDH和LDH。HBDH、LDH和總膽固醇在PC2上的荷載系數的絕對值>0.6。PC5上沒有荷載系數絕對值大于0.6的特征性生物化學指標。非監督性聚類分析顯示，6個特征性生物化學指標構成血清生物化學檢測數據中，PF樣本與正常對照組樣本能夠較明顯的區分開，PF樣本的分辨率為93.10%(27/29)，正常對照組樣本的分辨率為72.73%(40/55)(圖2)。

表3 12個特征性生物化學指標在前3個顯著主成分上的荷載系數Tab.3 Loading coefficients of the twelve significant changed indexes on the first three principle components

圖2 樣本根據6個特征性生物化學指標數據的雙向聚類熱圖Fig.2 Two-way clustering heat map of the six significantly altered biochemistry parameter data

2.3 特征性生物化學指標的判別能力

用PC1的6個特征性生物化學指標構建了PF和正常對照血清生物化學判別函數。FPF=-117.423 + 63.601×HBDH + 12.166×ALB-11.059 × LDH + 17.867 × PAB + 5.776 × A:G + 12.790 ×Ca；FHealthy=-116.557 + 58.243 × HBDH + 13.468 × ALB-10.819 × LDH + 19.623 × PAB + 7.674 × A:G + 12.771 × Ca。其中具有較大貝葉斯判別系數絕對值的特征性生物化學指標具有相對較強的判別能力。HBDH的貝葉斯判別系數絕對值，具有將PF從正常對照組樣本中區分開的判別能力。特征性生物化學指標的ROC曲線見圖3。在6個特征生物化學指標ROC曲線下面積分別為： HBDH=0.794(敏感度為0.759，特異度為0.818)，LDH=0.769(敏感度為0.724，特異度為0.764)，Ca=0.405，A:G=0.291，PAB=0.284，ALB=0.217。

圖3 受試者操作特征曲線分析Fig.3 Receiver operating characteristic (ROC) curve analysis

3 討論

本研究以臨床生物化學檢驗數據為依據，運用生物信息學技術成功構建了用于預測PF風險的生物化學檢驗數據模型。基于該模型，血清生物化學檢測可用于監測PF引起的體內血液成分的改變。發現了區分PF和正常對照組樣本的特征性生物化學指標，將為PF診斷提供數據支持。

LDH和HBDH是兩個具有較強特異性診斷意義的生物化學指標。LDH是無氧糖酵解和糖異生過程中的氫轉移酶，其5種LDH的同工酶(LDH-1-LDH-5)構成的同型模式可用于肺部疾病的診斷[7]。有研究[8]顯示，血清中LDH-3水平的升高出現在肺損傷之后，因此常被認為是急性肺損傷的判斷指標。而又有研究[9]顯示支氣管肺泡灌洗液中的LDH水平能夠用于鑒別肺結節病的良性與惡性。盡管LDH曾被報道是多種間質性肺疾病的潛在生物標志物[10]，但最終因特異性差的原因而沒有被廣泛應用。本研究結果仍然顯示LDH區分肺纖維化與正常對照血清的能力較低，這是由于和細胞損傷相關的許多因素可能引起血清中LDH的改變，如過熱或者過冷條件下的局部缺血，饑餓或者化學品中毒等[3]。

HBDH是LDH的同工酶，它與α-酮丁酸具有高親和性，并在心肌組織中含量豐富，尤其在患有心肌疾病患者的血清中含量明顯偏高。有研究[11]顯示，肺心病患者血清中HBDH與LDH的比值能夠作為心肌組織損傷的標記性指標。也有研究[12]顯示，呼吸衰竭患者血清中的LDH和HBDH緩慢上升，主要是由于細胞損傷造成了血碳酸過高及線粒體功能不全，ATP合成下降，鈉離子泵功能紊亂和細胞腫脹，由此引發的膜通透性增加及最終的酶滲出。另外，HBDH與LDH也可作為預測艾滋病患者發生卡氏肺孢子菌肺炎嚴重程度及病死率的潛在標志物[3]，但因特異性不強而沒有被進一步應用。本研究結果與之前的結果類似，但通過對血清生物化學數據進行挖掘分析，從數據模型角度揭示了HBDH和LDH與PF的相關性。

本研究從臨床生物化學檢測數據中提取PF的一般特征。基于更多不同類型PF樣本的研究將會在準確甄別各類PF方面取得新的突破。本研究結果顯示，HBDH是將PF血清樣本從正常對照中區分開的最有效常用生物化學檢測指標。更多關于HBDH在PF診斷方面的研究(如質譜學)，或者與其他血清標志物(如LDH)的聯合應用，將進一步明確其在PF診斷方面的價值。