搜風順氣丸對咪喹莫特誘導的銀屑病樣小鼠γδT17的抑制作用

郭肖瑤 底婷婷 趙京霞 王 燕 解欣然 翟春艷 劉正榮，2 蒙玉嬌，2 劉 宇，2 郭簡寧，2 張 璐 王 寧 張 蕾 李 萍*

(1. 首都醫科大學附屬北京中醫醫院 北京市中醫研究所 銀屑病中醫臨床基礎研究北京市重點實驗室，北京 100010; 2. 北京中醫藥大學，北京 100029)

銀屑病是一種炎性皮膚病。中醫稱為“白疕”[1]，《醫宗金鑒》謂白疕“此證俗名蛇風，生于皮膚，形如疥疹，色白而癢，搔起白皮。由風邪客于肌膚，血燥不能榮養所致”，搜風順氣丸可養血潤燥，祛風止癢。但目前對于其作用機制研究較少。本研究進一步觀察藥物作用環節，并揭示其可能的作用機制，作為臨床應用的理論依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

北京華阜康生物科技股份有限公司，8周齡，雄性，BALB/c小鼠40只，體質量18～20 g，實驗動物許可證號：SYXK(京)2018-006。

1.2 試劑、藥物及儀器

北京同仁堂制風順氣丸(Z11020031)，取一顆藥丸溶于13.3 mL雙蒸水中配成溶液備用。按照成人(60 kg)的劑量，根據人與動物間藥物劑量換算比例換算成小鼠劑量(0.68 g/mL)每日灌胃。四川明欣藥業有限責任公司制咪喹莫特乳膏，上海信誼藥廠有限公司制甲氨蝶呤片; H2O2去氧離子水; Ki-67單克隆抗體(美國eBioscience公司，160031); CD3一抗工作液(美國Abcam公司); 進口山羊血清工作液(北京中杉金橋生物技術有限公司)、PCR試劑盒公司(天根生化科技有限公司)等。正置顯微鏡和圖像采集系統(日本Olympus公司，BX51); 酶標儀(美國Thermo公司，Multiskan Spectrum); 垂直電泳儀(美國BIO-RAD公司，Mini-Protean3); 遠紅外激光成像系統(美國LI-COR公司)。

1.3 動物造模、分組、給藥

動物造模參考Nadeem等[2]銀屑病樣小鼠模型制備方法。戊巴比妥鈉(80 mg/kg)，腹腔注射麻醉，背部備皮 2 cm×3 cm，單籠飼養。對備皮后小鼠采用數字表法，隨機分為空白對照組、模型組、搜風順氣組及甲氨蝶呤組，每組10只?？瞻捉M小鼠背部每日涂抹等量凡士林，其余小鼠背部每日涂抹5%(質量分數)咪喹莫特乳膏 62.5 mg。 同時灌胃給藥，1次/d，每次 0.4 mL，連續6 d。

1.4 檢測指標及方法

1.4.1 皮損病理學改變、表皮Ki-67表達及CD3+T淋巴細胞浸潤

HE染色觀察皮損改變。并在400倍鏡下測量表皮厚度。免疫熒光染色觀察Ki-67的表達并在400倍鏡下，在陽性表達部位隨機選5個視野，觀察每例標本皮膚組織學改變并記錄陽性細胞數量。對皮損CD3+T淋巴細胞浸潤進行免疫組織化學法檢測并計算數量。

1.4.2 小鼠脾臟、胸腺、雙側腹股溝淋巴結的質量

第7天電子天平稱取脾、胸腺、雙側腹股溝淋巴結的重量，記錄脾指數[脾質量/體質量(mg/g×10)]、胸腺指數[胸腺質量/體質量(mg/g×10)]、淋巴結指數[淋巴結質量/體質量(mg/g×10)]并記錄數據。

1.4.3 流式細胞術分析小鼠雙側腹股溝淋巴結，胸腺細胞組成比例

常規制備組織單細胞懸液，每1×106細胞加入100 μL 抗-CD3和 抗-TCR-γ/δ熒光抗體標記γδT細胞，抗-CD3、抗-TCR-γ/δ和 抗-CD3和抗-TCR-RORγ熒光抗體標記 RORγt細胞，常溫避光孵育30 min。使用流式細胞儀檢測，FACSDiva分析。

1.4.4 皮損中STAT3相關通路蛋白磷酸化信號轉導與轉錄激活因子3(phosphorylated-signal transduction and activators of transcription 3，p-STAT3)表達的檢測

BCA試劑盒定量背部皮損提取的蛋白。加入p-STAT3及β-actin單克隆抗體進行蛋白質印記分析，計算灰度值。

1.5 統計學方法

2 結果

2.1 搜風順氣丸對咪喹莫特誘導的銀屑病樣小鼠模型皮損的影響

1)肉眼觀察: 空白對照組小鼠皮膚始終光滑、粉嫩，無任何改變。模型組于第 2～3 天開始出現皮損，背部紅色斑點逐漸從點擴大到片狀，鱗屑漸多、浸潤加重，第7天銀屑病樣模型形成。 甲氨蝶呤、搜風順氣組皮損與模型組同期相比，小鼠鱗屑明顯變薄、減少，鱗屑厚度減輕，紅斑色淺面積小，皮膚增厚程度輕，浸潤不明顯，皮損癥狀均有所緩解(圖1)。依據PASI評分可見與模型組相比, 甲氨蝶呤組及搜風順氣丸組的鱗屑、浸潤、紅斑及總體評分均有所降低，搜風順氣丸組在鱗屑、浸潤方面作用更為顯著(圖2)。

圖1 第7天各組小鼠皮損改變Fig.1 Gross observation of mice on day 7 of treatmentA: control group; B: model group; C: MTX group; D: SFSQ group; MTX: methotrexate; SFSQ: Soufengshunqi decoction.

圖2 咪喹莫特誘導的各組小鼠1～7 d 皮損 PASI 評分趨勢Fig.2 PASI scores of mouse skin lesions induced by imiquimod

2)表皮組織形態學:空白組表皮層較薄，模型組增厚數倍，角化不全，角化過度、嚴重炎性細胞浸潤，大量基底細胞核分裂; 甲氨蝶呤、搜風順氣組表皮比模型組薄、角化不全細胞較少，浸潤較輕，基底細胞核分裂不明顯，搜風順氣組改善尤為明顯(圖3)。

圖3 第7天表皮厚度測量及病理改變Fig.3 Histopathological observation of skin lesions on day 7 in each group

2.2 搜風順氣丸抑制咪喹莫特誘導的銀屑病樣小鼠皮損部位Ki-67陽性表達

空白組表皮內 Ki-67 陽性細胞局限于基底層且數量較少。 模型組于基底層棘層均大量表達，差異有統計學意義(P<0.001)，搜風順氣組局限于基底層且減少明顯(P<0.001)(圖4)。

圖4 免疫組織化學法染色監測各組小鼠皮損中 Ki-67 的表達Fig.4 Ki-67 expression in the skin lesions and the quantitative analysis of the Ki-67 staining positive cell numbers in the skin lesions of each group(IFC staining，400×)A: control group; B: model group; C: MTX group; D: SFSQ group; MTX: methotrexate; SFSQ: Soufengshunqi decoction.

2.3 搜風順氣丸抑制咪喹莫特誘導的銀屑病樣小鼠皮損中CD3的表達

空白組皮損真皮 CD3+T細胞較少，模型組真皮層陽性細胞數明顯增多，400倍顯微鏡視野下模型組CD3+T細胞數量明顯高于空白組; 甲氨蝶呤組、搜風順氣組細胞數量均低于模型組(表1，圖5)。

表1 各組7 d 后小鼠皮損中 Ki67、 CD3+ 的表達Tab.1 Comparison of the number of Ki-67，CD3+in high power microscopic after 7 days (positive cells number)

圖5 免疫組織化學法染色監測各組小鼠皮損中 CD3+ 的表達Fig.5 CD3+ cells in the skin lesions and the quantitative analysis of CD3+ positive cell numbers in the skin lesions in each group (IHC staining，400×)

2.4 搜風順氣丸改善咪喹莫特誘導的銀屑病樣小鼠免疫系統異?；罨?/h3>

第7天小鼠脾臟、胸腺、淋巴結指數，模型組脾指數高于空白組，兩者差異有統計學意義(P<0.05,圖6)，各用藥組脾的質量均較模型組低(P<0.001)。模型組淋巴結指數高于空白組(P<0.001)，各用藥組均較模型組低，其中搜風順氣組差異有統計學意義(P<0.01)。模型組胸腺指數高于空白組(P<0.01)。

圖6 第7天小鼠體質量、脾及脾指數、胸腺指數及雙側腹股溝淋巴結指數Fig.6 Body weight，spleen and spleen index，thymus index and lymph node index on day 7 of each group of mice n=10,*P<0.05，**P<0.01， ***P<0.001 vs model; MTX: methotrexate；SFSQ: Soufengshunqi decoction.

2.5 搜風順氣丸對咪喹莫特誘導的銀屑病樣小鼠淋巴結及胸腺CD3+T細胞的影響作用

各組小鼠雙側腹股溝淋巴結CD3+T細胞中CD4+T比例差異無統計學意義。 淋巴結γδTCR+比例可見模型組高于空白組且搜風順氣組小鼠γδT+比例低于模型組。γδ T+ RORγ T+在小鼠淋巴結 CD3+ T細胞中模型組表達明顯高于空白組(P<0.01)，并在搜風順氣組中降低。 而γδT+RORγt-在各組中均差異無統計學意義(圖7)。

圖7 各組小鼠雙側腹股溝淋巴結及胸腺 CD3+T細胞中 CD4+T、γδTCR+、γδT+RORγt+、γδT+RORγt-比例分析Fig.7 Analysis of CD4+T，γδTCR+，γδT+ RORγt+，γδT+RORγ T-proportion in lymph nodes and thymus CD3+T cells of each group

各組小鼠胸腺CD3+T細胞中CD4+T細胞比例，差異無統計學意義(P>0.05)。胸腺γδ T+比例可見模型組高于空白組，差異有統計學意義(P<0.05)，且搜風順氣組小鼠γδ T+比例低于模型組。 γδT+RORγt+在模型組表達高于空白組，并在搜風順氣組中降低。 而γδT+RORγt-在模型組高于空白組且搜風順氣組小鼠比例低于模型組 (P<0.01)。

2.6 搜風順氣丸抑制咪喹莫特誘導的銀屑病樣小鼠皮損中p-STAT3的表達

模型組p-STAT3的表達量高于空白組，相對于模型組，搜風順氣組在p-STAT3的表達較少(P<0.05,圖8)。

圖8 第 7 天小鼠皮損中 p-STAT3蛋白的表達Fig.8 Expression of p-STAT3 in skin lesionsat day 7 of treatment

3 討論

銀屑病中醫稱為“白疕”[3]。《醫宗金鑒》[4]記載“此證俗名蛇風，生于皮膚，形如疥疹，色白而癢，搔起白皮。由風邪客于肌膚，血燥不能榮養所致”。風邪常兼加他邪，致濕毒、風熱、風寒等。另外，腸胃無物不受，導致虛形于外熱毒積于中?？梢娿y屑病以風邪血燥為先，而后內蘊熱毒。因此當祛風養血潤燥，加以迫腑瀉熱?！夺t宗金鑒》[4]便首次記載:“治療白疕先以防風通圣丸，次服搜風順氣丸”。方中補養肝腎精血的牛膝、山萸肉、菟絲子、山藥等借枳殼、檳榔之行氣作用，達到滋潤肌膚的目的。氣行則血行，血行風自滅，故使用枳殼、檳榔行血，順氣破滯寬腸以助火麻仁、郁李仁、大黃滑利潤燥而通幽，而肺與主津液的大腸相表里，由此可借肺氣宣發以充養肌膚。 防風可祛除在上之風，獨活祛除在下之濕，車前子引山藥、牛膝、萸肉、菟絲子入肝腎之經[5]。

目前廣泛應用的銀屑病研究模型為咪喹莫特誘導的小鼠模型，可快速誘導出與人類銀屑病相似的皮膚表現。觀察皮損改變可見SFSQ組鱗屑薄且少，皮損表現較光滑、柔軟，紅斑色淺、面積小，浸潤程度更輕。小鼠鱗屑、浸潤和紅斑的積分降低，在降低疾病發展速度、減輕皮損加重程度上，搜風順氣丸均有明顯作用。 作為核抗原的 Ki67可反映細胞增生情況[6-7]，搜風順氣丸可以抑制表皮棘細胞層的異常增生，而不影響基底層細胞的正常增生。同時減少真皮質 CD3+ T淋巴細胞浸潤，抑制T細胞增生。減輕脾臟及淋巴結的重量，改善免疫系統的異?；罨?。

搜風順氣丸還可同時降低腹股溝淋巴結中及胸腺中γδT+RORγt+細胞比例從而抑制 IL-17的產生。作為胞質蛋白家族[8]，STATs參與細胞信號轉運[9]。 STAT3通路可調控產生IL-17的細胞分化與分泌[10-11]。 銀屑病患者皮損中 STAT3 處于高表達狀態[12-13]。搜風順氣丸可減少 p-STAT3蛋白的表達含量，抑制 STAT3通路的異?；罨档?IL-17類細胞因子的分泌，從而抑制銀屑病炎性反應狀態。

本次研究中通過銀屑病樣小鼠模型的建立，觀察到皮損部位的減輕改變，減少γδT細胞，尤其是γδT17在胸腺組織中的浸潤比例，同時還可以抑制 STAT3通路的磷酸化，降低 IL-17類細胞因子的分泌以減輕免疫反應。作為臨床治療銀屑病常用的免疫抑制劑，甲氨蝶呤可改善患者癥狀，但具有長期服用安全性較差、易引起不良反應導致病情惡化的缺點。針對銀屑病病因未完全明確、無特效藥物的現狀，復方中藥因臨床療效確切且不良反應少成為研究熱點，具體作用機制亟待深入探索。以上研究為中醫藥臨床治療提供了基礎理論依據，并為方劑的優化提供方向。