補脾益腎起痿湯對實驗性自身免疫性重癥肌無力(EAMG)大鼠模型免疫機制的影響

張運克，劉沖沖，王曉含

(1.河南中醫藥大學，河南 鄭州 450046；2.河南中醫藥大學第一附屬醫院，河南 鄭州 450000；3.北京中醫藥大學，北京 100029)

重癥肌無力(myasthenia gravis，MG)是一種涉及細胞免疫和體液免疫等多病機的自身免疫性疾病[1-3]，其主要病理損害在神經肌肉接頭處的突觸后膜，且發病機制復雜[4]，主要由體液免疫介導的乙酰膽堿受體(AChR)抗體及補體系統參與而起病。補脾益腎起痿湯由補中益氣湯合二仙湯加減化裁而成，是全國第三、四批名老中醫鄭紹周教授治療重癥肌無力的常用方劑，經多年的臨床實踐與觀察，對脾腎虧虛型的肌無力患者治療有效率高達80%。為探索本方治療MG的作用機制，我們通過人工合成免疫原法構建EAMG大鼠模型，分別應用抗原包被法、免疫光比濁法檢測大鼠血清中AChR-Ab的水平變化及血清總IgG、補體C3、TGF-β1的濃度變化，初步探討了補脾益腎起痿湯治療MG的免疫學機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與分組

于北京維通利華實驗動物技術有限公司采購健康LEWIS雌性大鼠60只，年齡42～62天，體質量150～160 g，合格證號：11400700140544。大鼠飼養在河南省醫藥科學研究院SPF級實驗動物中心進行。采用隨機數字表法將大鼠分為補脾益腎起痿湯高中低3個劑量組、西藥(強的松)組、模型組及空白對照組共6個組，每組大鼠各10只。

1.2 實驗儀器及試劑

人工合成鼠源性AChR-α亞基97～116肽段序列免疫原：購自上海淘普生物科技有限公司，規格：6 mg/支，分子量：2252.62，純度：98.67%，序列號：DGDFAIVKFTKVLLDYTGHI(20aa)；完全福氏佐劑(CFA)、不完全福氏佐劑(IFA):購自美國Sigma公司,規格：10 mL/瓶，CFA貨號：F-5881，IFA貨號：F-5506；磷酸鹽緩沖液(PBS)：購自北京索萊寶科技有限公司；大鼠/TGF-β1 ELISA試劑盒：購自北京達科為生物技術有限公司；大鼠/補體C3、大鼠/總IgG ELISA試劑盒：購于南京建成科技有限公司；iMark酶標儀：購自北京友華照欽醫療器械有限公司。

1.3 實驗藥物

補脾益腎起痿湯方劑組成：黃芪50 g，生白術15 g，黨參20 g，升麻15 g，柴胡15 g，陳皮10 g，當歸15 g，炙甘草15 g，仙茅15 g，仙靈脾15 g。將上述藥物濃煎至生藥濃度為0.74 g/mL。

醋酸潑尼松片：購自鄭州大學第一附屬醫院河醫院區，貨號：H33021207。

1.4 實驗模型制備

參考許文華[5]免疫乳劑的制備構建實驗模型。首次免疫:按照1∶1.5∶1.5的比例將R97～116、CFA、PBS三者充分混勻，于造模組大鼠足墊部、鼠背部多點注射200 μL乳劑(含100 μg R97～116)，于對照組大鼠注射同等劑量的CFA與PBS混合乳劑。第二次及第三次免疫：按照1∶1∶1的比例將R97～116、IFA、PBS三者充分混勻，在首次免疫后的第30天及第45天,取200 μL乳劑(含100 μg R97～116)于造模組大鼠強化接種。

三次免疫結束后每隔2天對大鼠進行肌力測定。依據Lennon[6]分級法將大鼠肌力分為4級，0級：沒有肯定肌無力的表現，記0分；1級：休息時無明顯異常，但四肢力量較弱，前肢乏力易疲勞，記1分；2級：休息時無精打采，抓握4～5次出現前肢無力，且動作欠協調，毛發不澤，記2分；3級：較重肌無力表現，抓握不能，呼吸喘粗，肌肉震顫，甚至死亡，記3分，嚴重者記4分。若癥狀介于兩級之間則記為0.5、1.5、2.5分，且數值可隨肌力表現上下浮動。

1.5 給藥方法

各組大鼠分別連續灌胃4周。其中補脾益腎起痿湯低、中、高濃度組大鼠分別按16.2 mg/(kg·d)、32.4 mg/(kg· d)、64.8 mg/(kg·d)劑量給予實驗藥物灌胃，西藥組大鼠給予醋酸潑尼松片5.4 mg/(kg·d)，模型組與空白組大鼠給予生理鹽水3 mL/d。

1.6 實驗指標的測定

1.6.1 新斯的明試驗

從免疫后第50天的造模組大鼠中隨機選取5只，給予新斯的明試驗以觀察大鼠肌力的改變情況。新斯的明按照37.5 μg/kg的劑量予腹腔注射,同時予阿托品15 μg/kg腹腔注射拮抗新斯的明毒蕈堿樣反應。若12 min后大鼠活動明顯增加，抓握時肌力明顯改善，癥狀改善狀態持續2～12 h，則為新斯的明試驗陽性。

1.6.2 重復神經電刺激測肌電圖

將經過腹腔注射麻醉后的大鼠固定于平板上，切開腓腸肌并暴露坐骨神經，并將記錄電極、刺激電極分別置于腓腸肌和坐骨神經上,然后用電生理記錄儀記錄復合動作電位振幅，電極刺激頻率分別為5 Hz和10 Hz，刺激部位為坐骨神經，檢測完成后予創口處縫合并予青霉素外敷預防感染。衰減值用第5個動作電位與第1個動作電位的變化百分比表示。

1.6.3 血清中AChR-Ab、TGF-β1、補體C3及IgG水平測定

取大鼠腹主動脈血約5 mL，離心機10 000轉/min離心15 min，EP管每管120 μL分裝并放置于-20℃冰箱保存。血清使用前10 h放于4℃冰箱緩慢解凍，若有沉淀則快速離心1 min，然后采用抗原包被法測定大鼠血清中AChR-Ab水平，采用免疫光比濁法測定大鼠血清中TGF-β1、補體C3、IgG水平。

1.7 統計學方法

2 實驗結果

2.1 各組大鼠Lennon評分與血清AChR-Ab濃度

模型組大鼠表現為前肢抓握乏力，嘶咬咀嚼無力，體質量增長較緩慢或減輕，毛發不榮，空白組大鼠則無明顯異常。對各組大鼠進行血清AChR-Ab濃度測定，并對模型組大鼠首次免疫50天后進行肌力測定，其中評分小于1分、1分至1.5分之間、1.5分至2分之間、2分以上的大鼠分別有4只、3只、20只、23只。

見表1。在肌力評分方面，空白組低于模型組，具有統計學意義(P<0.01)，說明模型組大鼠肌力明顯減退，EAMG大鼠模型制作成功；在血清AChR-Ab(OD值)方面，空白組低于模型組，具有統計學意義(P<0.05)。

表1 大鼠肌力評分與血清AChR-Ab濃度結果

注：與空白組相對比，▲P<0.05,▲▲P<0.01

2.2 新斯的明試驗

大鼠行新斯的明試驗12 min后，觀察到其精神狀態明顯好轉，活動明顯增多，肌力明顯提高。見表2。模型組Lennon評分高于空白組，具有統計學意義(P<0.05)。

表2 模型組大鼠在注射新斯的明前后Lennon評分比較分)

注：與注射前評分相比，△P<0.05

2.3 重復神經電刺激檢測肌電圖

從造模組大鼠中隨機選取5只行肌電圖檢查，衰減值用第5個動作電位對第1個動作電位的變化百分比表示，其大于10%。見圖1及表3。

A EAMG1號

B EAMG2號

C EAMG3號

D EAMG4號

E EAMG5號

F 正常組

表3 肌電圖波值(圖1)

注：圖EAMG1-5組第五波與第一波波值相比電位衰減值>10%，圖1正常組電位基本無變化

2.4 各組大鼠血清中TGF-β1、補體C3、IgG濃度比較

見表4。與空白組相比較，模型組大鼠血清中TGF-β1及補體C3濃度均顯著降低(P<0.01)，應用西藥及高中低濃度劑量中藥治療后，TGF-β1及補體C3濃度均有一定程度的升高，與模型組相比較，均具有統計學意義(P<0.01)；與西藥組相比較，高中低濃度劑量中藥治療后TGF-β1及補體C3濃度均降低，但不具有統計學意義(P>0.05)。

與空白組相比較，模型組大鼠血清中IgG濃度明顯升高(P<0.01)，應用西藥及高中低濃度劑量中藥治療后，IgG濃度有一定程度的降低，與模型組相比較，具有統計學意義(P<0.01)；與西藥組相比較，高中低濃度劑量中藥治療后IgG濃度增高，但不具有統計學意義(P>0.05)。

表4 各組大鼠血清中TGF-β1、補體C3、IgG濃度比較

注：與空白組相比較，△P<0.01;與模型組相比較，●P<0.01

3 討論

重癥肌無力是一種由體液免疫介導、細胞免疫依賴及補體參與的疑難性自身免疫性疾病，主要針對神經肌肉接頭 (neuromuscular junction，NMJ)突觸后膜的AChR，其中約74%～88%的全身型MG患者AChR抗體呈陽性[7-8]。IgG抗體能促進單核巨噬細胞的吞噬作用，是體液免疫應答中的關鍵因子，其亞型包括IgG1、IgG2、IgG3、IgG4，以IgG1和IgG3亞型為主的AChR抗體與突觸后膜AChR結合后可激活補體系統[9-10]，使NMJ處沉積大量補體，并形成膜攻擊復合物 (membrane attack complex，MAC)，導致補體溶解，AChR被破壞、內吞，從而造成NMJ傳遞功能障礙，因此MG發病與補體系統的激活密切相關。補體因子可輔助或增強抗體分子，對機體的防御及免疫系統功能的調節至關重要，補體C3處于補體經典激活途徑和旁路激活途徑的匯合點，且是補體系統中含量最高、最重要的成分，有著重要的生物學功能[11-12]。C3被激活后裂解產生的大片段C3b與細胞表面結合形成C5轉化酶，C5裂解產生的大片段C5b與C6～9形成C5b-9復合物，剩余部分在細胞表面結合形成MAC，從而溶解細胞[13]。補體系統活化狀態與補體活化產物循環有關[14]，有研究發現小鼠被敲除C3基因后，無法成功構建EAMG模型，AChR抗體水平亦隨之降低，正常狀態下AChR抗體水平與B細胞數量及細胞因子表達密切相關，C3基因缺失小鼠NMJ突觸后膜上存在IgG沉積，但無補體C3和MAC，表明C3基因缺失可影響MAC介導的免疫損傷，亦可調節免疫系統，從而降低小鼠自身免疫反應的機率[15]。在自身免疫性炎性反應過程中TGF-β1可發揮多種作用[16]：①T、B淋巴細胞功能可被抑制；②可衰減或抑制炎性反應，起負性調節；③可拮抗細胞炎性因子TNF-α，減少細胞間黏附分子的表達，使免疫下調，促進炎癥修復。有報道發現[17]TGF-β1含量在EAMG大鼠血清中較正常組低，且疾病嚴重時下降幅度更大。

補脾益腎起痿湯由補中益氣湯合二仙湯君藥組成，對辨證屬脾腎虧虛型肌無力(痿證)臨床療效顯著，遵循“治痿獨取陽明”原則。補中益氣湯是補益脾胃代表方，其功效為補益中氣、升陽舉陷，研究表明由補中益氣湯化裁的益氣升提方[18]可以減輕由Rα97-116免疫Lewis大鼠構建的EAMG模型的臨床癥狀，其可能通過提高TGF-β含量而發揮療效。梁麗萍等[19]報道補中益氣湯通過降低IgG、升高補體C3的濃度治療氣虛發熱，張富強[20]報道：補中益氣湯可通過藥物間相互作用調節體液免疫應答，進而抑制AchRAb的產生，減輕神經肌肉接頭功能損害，緩解肌無力癥狀。脾胃虧虛日久，造成腎陽虧虛，故加二仙湯君藥仙茅、仙靈脾，達到脾腎雙補作用。仙茅、仙靈脾可上調脾細胞培養上清中IL-1、IFN-γ及IL-5的含量[21]。徐鵬等[22]報道：補脾益腎藥物可以通過調控免疫相關細胞因子的變化，改善EAMG動物的臨床癥狀。對本研究結果分析發現補脾益腎起痿湯通過下調人工合成免疫原制作實驗性自身免疫性重癥肌無力(EAMG)大鼠模型血清總IgG，上調TGF-β1、補體C3水平表達，降低血清AChR-Ab濃度，從而發揮免疫調節功能，減輕肌無力癥狀。本研究從免疫調節角度探討補脾益腎方劑治療重癥肌無力的作用機理，這為中藥復方治療重癥肌無力提供了新的思路。