緊密連接蛋白Claudin-1、7在日光性角化病和皮膚鱗狀細胞癌中的表達

黃秋紅 周吉文 趙麗欣 朱靈燕 潘永年

Claudins蛋白是一類跨膜蛋白家族，在人體多種組織中均有表達，具有維持緊密連接的屏障功能和柵欄功能，若其表達異常可導致上皮細胞及內皮細胞的結構破壞，極性喪失，細胞間黏附力下降，進而導致多種腫瘤的發生、侵襲與轉移[1]。因此，Claudins蛋白與腫瘤的相關性研究已成為近年來研究的熱點。Claudin-1、7均是Claudins蛋白家族的重要成員，在維持細胞極性和屏障功能方面起著重要作用。目前為止，Claudins蛋白與皮膚腫瘤的相關性研究報道較少。因此，本研究擬通過免疫組織化學方法檢測Claudin-1、7蛋白在AK和SCC中的表達，從而初步探討Claudin-1、7在AK和SCC發病機制中的作用，為其早期診斷和基因靶向治療建立實驗基礎。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 Claudin-1、7 兔抗人多克隆抗體購自Abcam公司，免疫組化SP試劑盒、DAB顯色試劑盒購自南京凱基生物發展有限公司。

1.2 樣本資料 收集2014年11月至2016年11月于我院皮膚科就診患者，結合臨床表現及組織病理確診為AK和SCC各30例，男女比例1∶1，其中SCC組均為高分化鱗癌。正常對照組30例來源于手術切除時所帶的正常皮膚組織。所有標本都具有典型或較為典型的皮損，并且通過HE染色證實均具有典型的病理學改變。

1.3 免疫組織化學方法檢測組織樣本中Claudin-1、7蛋白的表達 將所有標本按常規方法進行石蠟包埋、切片，嚴格按照試劑盒步驟進行檢測。(1)抗原修復：先將放有切片的耐高溫塑料染色架放入盛有抗原修復液的燒杯中，高火檔至煮沸，將燒杯取出置于電熱器上保持微沸狀態20 min，而后將燒杯浸入流水中自然冷卻后用PBS浸洗3次。(2)滅活酶：每張切片滴加2滴3% H2O2-甲醇溶液，室溫封閉10 min。PBS浸洗3次。(3)封閉：滴加即用型山羊血清50～100 μL，室溫孵育20 min。(4)抗原-抗體反應：滴加一抗(1∶100稀釋)50～100 μL，37℃，濕盒孵育2 h，PBS浸洗3次。(5)加增強劑：滴加增強劑50 μL，室溫濕盒孵育30 min。PBS浸洗3次。(6)一抗二抗反應：滴加通用型IgG抗體-Fab段-HRP多聚體50 μL，室溫孵育30 min。PBS清洗3次。(7)顯色、復染，最后脫水封片，光學顯微鏡下觀察。

1.4 結果判定 高倍鏡下選取10個視野，綜合染色強度和陽性細胞所占比例進行半定量測定。染色強度評分標準：不著色為0分，淺黃色為1分，棕黃色為2分，黃褐色為3分。陽性細胞所占比例評分標準：陽性表達細胞數<5%為0分，5%～35%為1分，35%～65%為2分，>65%為3分。兩者評分相乘，0～2分為陰性，3～9分均判斷為陽性。

1.5 統計學方法 本實驗的數據分析均通過SPSS 13.0統計學分析軟件進行。Claudin-1、7在癌旁正常表皮、AK和SCC中免疫組化陽性率間的比較采用χ2檢驗；P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 Claudin-1蛋白在癌旁正常表皮、AK和SCC中的表達 經免疫組化檢測結果顯示，在癌旁正常表皮中，Claudin-1蛋白呈強陽性表達(100%)，主要定位于角質形成細胞膜上(圖1，表1)；在AK中，Claudin-1蛋白主要表達于表皮上層細胞，集中在細胞膜上，下層細胞表達明顯減弱甚至不著色(圖2)；在SCC中，大部分腫瘤細胞Claudin-1蛋白表達陰性(圖3)。Claudin-1蛋白在AK和SCC中的陽性表達率分別為53.33%(16/30)和13.33%(4/30)(表1)，較癌旁正常表皮均明顯降低(P<0.05)，且Claudin-1蛋白在SCC中的表達水平明顯低于AK(P<0.05)。

表1 癌旁正常表皮、AK和SCC中Claudin-1蛋白表達陽性率

2.2 Claudin-7蛋白在癌旁正常表皮、AK和SCC中的表達 經免疫組化檢測結果顯示，Claudin-7蛋白在癌旁正常皮膚組織、AK和SCC中表達缺如(圖4～6)。

圖1癌旁正常表皮中 Claudin-1蛋白主要定位于角質形成細胞膜上，呈強陽性表達(免疫組化，×100)圖2AK中Claudin-1蛋白在表皮下層細胞表達明顯減弱甚至不著色(免疫組化，×100)圖3SCC中大部分腫瘤細胞Claudin-1蛋白表達陰性(免疫組化，×100)

圖4～6 Claudin-7蛋白分別在癌旁正常表皮、AK和SCC中表達缺如(免疫組化，×100)

3 討論

皮膚覆蓋體表，是機體內、外環境的分界，也是人體最大的器官，其擔負著屏障、吸收、感覺、物質代謝、免疫防御等重要功能。Claudin蛋白主要在上皮細胞相鄰面的胞膜上表達或分布，以形成細胞間的緊密連接，其表達情況直接決定皮膚的完整程度，參與炎癥、腫瘤等疾病的發生、發展。研究發現不同組織器官Claudin蛋白的表達是不同的，大部分組織器官可有兩種以上Claudin蛋白表達[2]。本實驗著重研究Claudin-1、7在正常表皮和表皮腫瘤組織中的表達，免疫組化結果顯示：在正常表皮中Claudin-1蛋白呈強陽性表達，且主要定位于角質形成細胞膜上，呈棕褐色，該結果與翁立強等[3]研究結果基本一致，而Claudin-7在癌旁正常表皮中表達缺如。

研究表明，Claudin蛋白在腫瘤中的表達具有組織特異性，且同一種Claudin蛋白在不同腫瘤組織中的表達或者在同一類型腫瘤的不同病理亞型中的表達亦各不相同，這種表達的差異性為腫瘤的診斷、治療均提供了新的思路。Claudin-1、7均是構成緊密連接蛋白的重要骨架蛋白，在多種腫瘤中均存在異常表達，并與腫瘤的進展和轉移有關。研究證實，Claudin-1在乳腺癌和結腸癌中表達降低[4，5]，Claudin-7在多種腫瘤中也表達下降，且下降程度與腫瘤組織學分級呈正比，有學者認為它是潛在的腫瘤抑制劑。在口腔鱗狀細胞癌中Claudin-7表達缺失，并與腫瘤病理分級、TNM分期、血管侵犯、癌細胞浸潤等有關[6]。Claudin-7基因敲除可導致食管鱗癌細胞e-cadherin表達降低，從而加速腫瘤細胞的生長和浸潤。Claudin-7基因敲除細胞具有較高的erk1/2磷酸化水平，但隨著Claudin-7的恢復，細胞增殖、侵襲能力和erk1/2磷酸化水平將顯著降低[7]。由此認為Claudin-7在抑制腫瘤侵襲和增殖方面具有重要的作用，可能是一個潛在的治療分子靶點。這些關于腫瘤中Claudin蛋白表達減少的報道與普遍接受的觀點是一致的，即腫瘤的發生常常伴隨著緊密連接結構的破壞，表現為癌細胞黏附力喪失、侵襲性強和分化差等方面。事實上，許多已發表的研究報告也發現一部分腫瘤中存在Claudin-1、7蛋白的過度表達。在食管鱗狀細胞癌中Claudin-1的表達異常增加，主要分布在腫瘤細胞核中，并通過AMPK/STAT1/ULK1信號途徑觸發自噬，從而促進食管鱗癌的增殖和轉移[8]。Claudin-7在肝細胞癌、未分化和低分化鼻咽癌中的表達均明顯增加。這種Claudin-7上調引起的致癌作用可能是其棕櫚酰化后通過與MMPs的相互作用，促進細胞外基質的降解，從而加速腫瘤細胞的運動，促進腫瘤的進展[9]?？傊瓹laudin-1、7在不同腫瘤組織中差異性表達的確切機制仍不清楚，但已證實受多種細胞因子、轉錄因子的調控。

近年來，國外部分學者已經開始關注Claudin蛋白在皮膚腫瘤中的表達。Tas等[10]研究發現黑色素瘤患者的血清Claudin-1水平顯著低于健康人群，但已知的臨床變量，包括患者年齡、性別、病變部位、組織學、淋巴結受累、疾病分期、血清乳酸脫氫酶水平和化療反應，與血清Claudin-1濃度均無相關性。另有研究證明Claudin-1的下調或丟失參與黑素瘤腦轉移的形成，它可能是黑素瘤腦轉移高?；颊叩囊粋€預測因子[11]。皮膚腫瘤是皮膚科常見的多發性疾病，其中AK和SCC屬于一個病譜疾病，前者屬于癌前期病變，有時可發展為SCC，后者系起源于角質形成細胞的惡性腫瘤，易發生轉移，可由各種癌前期疾病演變而來。Lee等[12]將不同病理分級的AK與健康正常皮膚的Claudin-1表達比較分析后發現，Claudin-1從正常皮膚到重度AK的表達呈逐漸下降的趨勢，尤其是在表皮不典型的區域，由此提出Claudin-1可能是AK病理嚴重程度的一個有用指標。與之一致的是，本研究同樣發現較癌旁正常表皮，Claudin-1蛋白在AK中的表達是下調的，另外我們發現Claudin-1蛋白在SCC中的陽性表達要明顯低于AK，由此看出，Claudin-1蛋白的表達水平與表皮腫瘤病變的嚴重程度平行，故我們推測Claudin-1的表達下調或缺失與SCC的發生、發展密切相關，可能與細胞間的緊密結構破壞、極性喪失，細胞間黏附力下降有關。

但在我們的實驗中，Claudin-7蛋白無論在正常表皮，還是在AK和SCC中都是呈陰性表達的，在一定程度上說明Claudin-7與SCC的發生、發展無直接聯系。但有文獻指出，Claudin-7在SCC中的陽性表達較正常皮膚中高，在癌前期病變中則無明顯表達，說明它是表皮腫瘤發生過程中的晚期事件。在Hintsala等[13]的研究中，34例SCC中僅有2例有較強的Claudin-7表達，42例AK中Claudin-7陰性表達者較SCC多，該結果與本實驗結果不完全符合，可能與收集的樣本量不夠和SCC的分期、類型不同有關，有待進一步研究證實。

本研究雖然從組織學上證實Claudin-1蛋白在AK和SCC中呈現遞減表達，推測其與表皮腫瘤的惡性轉化相關，但細胞發生惡性變是一個多因素、多階段的復雜過程，一些具體的作用分子機制如其與細胞內、外其他物質間的相互作用關系、調節機制仍未完全明了，值得我們進一步探索。