質子泵在不同氮素形態調控茶樹磷素吸收的功能研究

陳林木，陳景光，王寧寧，張顯晨*

質子泵在不同氮素形態調控茶樹磷素吸收的功能研究

陳林木1，陳景光2，王寧寧1，張顯晨1*

1. 安徽農業大學茶樹生物學及資源利用國家重點實驗室，安徽 合肥 230036 2. 中國農業科學院深圳農業基因組研究所，廣東 深圳 518116

磷是植物生長發育的重要礦質營養元素之一，不同氮素形態均影響植物對磷素的吸收。植物細胞膜H+-ATPase在礦質營養元素吸收過程中具有重要調控作用，因此不同氮素形態調控茶樹磷素吸收可能與細胞膜H+-ATPase相關。本研究采用二相分離法提取茶樹根系質膜，并通過非損傷微測（NMT）、Western-blot等技術探究不同氮素形態對舒茶早根系磷素吸收和細胞膜H+-ATPase特征參數的影響。結果表明，銨態氮提高茶樹對磷素的吸收；其茶樹根系細胞膜電位、H+跨膜運輸、H+-ATPase活性和蛋白表達均高于硝態氮處理；且細胞膜H+-ATPase專一抑制劑正釩酸鈉（Na3VO4）顯著減少不同氮素形態下茶樹根系對磷素的吸收和富集。由此可見，茶樹根系H+-ATPase可能參與不同氮素形態調控磷素的吸收。

銨態氮；硝態氮；磷素吸收；細胞膜H+-ATPase；茶樹

茶樹[(L.) O. Kuntze]是一種多年生經濟類木本植物[1-2]。磷是植物生長發育過程中所必需的大量營養元素之一，是ATP、磷脂和核酸等許多大分子物質的重要組成成分[3-4]。磷素參與茶樹葉部光合作用和根部有機酸的代謝[5]，且調控茶樹葉部氨基酸，多酚類和黃酮類化合物的合成[6]。因此，研究茶樹磷素營養對探究茶樹生長發育具有重要意義。目前關于茶樹磷素吸收的研究主要集中在生理生態上。Ruan等[7]通過土培試驗研究不同氮素形態對茶籽苗（4~5葉）磷素吸收的影響，結果表明，銨態氮顯著酸化根際土壤，并促進茶樹對磷素的吸收，而硝態氮對根際土壤pH和磷素吸收均無顯著影響。Zoysa等[8]采用土培試驗，比較斯里蘭卡3種茶樹品種（TRI2023，TRI2025和S106）的根際土壤磷素有效性和磷素吸收效率，發現TRI2023和TRI2025表現出較高的磷素吸收效率。但是關于哪些因素參與調控茶樹磷素吸收的研究目前鮮有報道。

植物細胞膜H+-ATPase（質子泵）是重要的離子泵[9]，主要利用水解ATP產生的能量將細胞內的H+泵至胞外，產生H+電化學梯度并調控離子和小分子等物質的跨膜運輸[10-11]。前人研究[12]表明，通過增加白羽扇豆排根（Proteoid root）細胞膜H+-ATPase的活性，加速H+外排并酸化土壤，提高白羽扇豆根部對磷素的吸收。此外，通過藥理學試驗發現，植物細胞膜H+-ATPase促進劑殼梭孢素（Fusicoccin）提高大豆對磷素的吸收和富集，而抑制劑Na3VO4則相反，說明大豆根系細胞膜H+-ATPase可能參與了調控大豆根部對磷素的吸收[13]；相同報道也發現，細胞膜H+-ATPase促進劑殼梭孢素增強了浮萍對磷素的吸收[14]。但是關于氮素是否通過調控茶樹根部細胞膜H+-ATPase影響磷素吸收的系統研究，目前尚未見相關報道。

本研究將采用二相分離法、非損傷微測技術和Western-blot等方法，探究銨態氮和硝態氮對茶樹磷素吸收和根系細胞膜H+-ATPase的影響。研究結果將為揭示茶樹調控磷素吸收的生理機制提供理論基礎，并為茶樹栽培中的磷肥合理施用提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗材料為半年生舒茶早扦插苗，種植于安徽農業大學茶樹生物學與資源利用國家重點實驗室農翠園，于2018年3月中旬扦插，9月下旬取樣。

1.2 試驗方法

1.2.1 材料處理

扦插苗植于營養液中后轉移至人工氣候室。溫室條件：光照時間12?h·d-1，室溫(22±1)℃，光照強度約270?μmol·m-2·s-1，空氣濕度45%~50%。茶樹水培營養溶液大量元素濃度（mmol·L-1）：NH4+(1.037)、NO3-(0.383)，P(0.1)、K(0.513)、Ca(0.329)、Mg(1.029)；微量元素濃度（μmol·L-1）：Zn(1.53)、Cu(0.39)，Mn(18.2)、B(9.25)、Mo(0.53)、Al(0.77)、Fe(6.27)；pH值調節至5.00~5.50，定時供氣[15]。

茶苗培養2周后，挑選長勢相近的茶苗（株高25~30?cm）定植于容量為4?L的水桶中。銨態氮和硝態氮處理組：水桶中分別盛有NH4+和NO3-濃度為1.42?mmol·L-1的茶樹水培營養溶液，處理7?d，每組設置5個重復。

1.2.2 茶樹磷含量的測定

采用鉬銻抗比色法測定茶樣根、莖和葉中的磷含量。取0.10~0.20?g干樣于5?mL濃硫酸中靜置過夜。在石墨消解儀上300℃消解樣品，消煮液至黑色時滴加30% H2O2，重復2~3次直至消煮液呈清亮色。消煮完成后轉移樣品溶液于100?mL容量瓶中，定容搖勻。取5?mL樣品溶液于50?mL容量瓶中，調節溶液酸度，再加入鉬銻抗顯色劑5?mL，定容搖勻。室溫靜置30?min，于紫外分光光度計700?nm測定吸光值，根據標準曲線計算磷含量[16]。

1.2.3 茶樹根系細胞膜電位的測定

細胞膜電位在南京林業大學NMT（Non-invasive Micro-test Technique）服務站完成測定。取茶樹根部樣品于培養皿中靜置30?min，培養皿中含基礎鹽溶液：0.1?mmol·L-1CaCl2和0.5?mmol·L-1KCl，pH 5.7[17]。用微電極探測茶樹根部成熟區膜電位，待電位穩定后，在培養皿中分別加入銨磷溶液和硝磷溶液，使其氮和磷濃度分別為1.42和0.1?mmol·L-1，記錄10?min內膜電位變化，每組8個重復[17-18]。

1.2.4 茶樹根系細胞膜H+流的測定

細胞膜H+流在北京旭月公司測定。預先制備選擇性H+微電極以確保瞬時離子流速度和方向的準確性。為探測茶樹根部H+跨越質膜時電信號的真實變化，需要加入BSM溶液（0.1?mmol·L-1CaCl2和0.5?mmol·L-1KCl，pH 5.7）作為電解液[19]。將H+微電極固定于處理后茶樹根部的成熟區（5~35?μm），并將相應的電極固定于茶苗根尖區（2?μm），待信號穩定后記錄10?min內離子流速，每組8個平行樣[20-21]。

1.2.5 茶樹根系細胞膜H+-ATPase的提取和酶活測定

取約3.5?g茶樹新生根系，加入18?mL預冷研磨緩沖液研磨為勻漿，緩沖液組成為：pH=7.6，25?mmol·L-1Hepes-Tris，50?mmol·L-1甘露醇，3?mmol·L-1乙二醇四乙酸，3?mmol·L-1乙二醇雙氨基乙基四乙酸，250?mmol·L-1氯化鉀，2?mmol·L-1苯甲基磺酰氟，1%（/）聚乙烯吡咯烷酮，0.1%（/）牛血清蛋白，2?mmol·L-1二硫蘇糖醇。紗布過濾后于4℃下11?500×離心10?min。取上清液在87?000×下離心45?min，沉淀為膜微囊體。采用兩相分離系統[6.2%（/）葡聚糖T-500和6.2%（/）聚乙二醇3350]從膜微囊體分離得到細胞質膜[22]。分別采用細胞質膜、液泡膜和線粒體膜的專一性抑制劑Na3VO4，硝酸鉀（KNO3）和疊氮化鈉（NaN3）驗證根系細胞膜H+-ATPase純度[23]；通過測定無機磷釋放量，計算其與空白對照的差值得出細胞膜H+-ATPase酶活[24]。

1.2.6茶樹根系細胞膜H+-ATPase的凝膠電泳和免疫檢測

采用BCA法測定蛋白濃度，再調節每組蛋白濃度一致。15?μg變性蛋白樣品于電泳系統中進行分離，完成后將蛋白片段轉移至PVFP膜上，5%（/）的脫脂奶粉TBST溶液室溫封閉2?h。用植物質膜H+-ATPase抗體（AS07 260，購于瑞典Agrisera公司）將PVFP膜孵育過夜。再將PVFP膜于二抗（Anti-rabbit IgG，HRP-linked Antibody #7074，購于上海玉博生物科技有限公司）中室溫孵育2?h，最后在凝膠成像儀中顯影，用Image Lab軟件進行結果分析[25]。

1.3 數據處理與分析

試驗數據用Excel軟件進行分析處理；用DPS v15.10軟件作單因素方差分析；組間差異用Tukey法進行多重性比較。

2 結果與分析

2.1 銨態氮和硝態氮對茶樹磷素吸收的影響

本研究通過水培體系研究發現，銨態氮處理促進了茶樹對磷素的吸收和富集，在整個植株富集量達到25.24?mg·g-1，與硝態氮處理相比顯著提高15.2%，且達到1%的顯著性差異（圖1）。

2.2 銨態氮和硝態氮對茶樹細胞膜電位的影響

采用非損傷微測技術檢測銨態氮和硝態氮處理對茶樹根系成熟區細胞膜電位的影響。如圖2-A所示，外源施加銨態氮和硝態氮，膜電位均表現出去極化趨勢；銨態氮處理調控膜電位去極化至-86.03?mV，與硝態氮處理（-58.74?mV）相比顯著增加約46.45%（圖2-B）。

2.3 銨態氮和硝態氮對茶樹根系細胞膜H+流的影響

本研究采用非損傷技術探究銨態氮和硝態氮調控茶樹根系H+流的影響。如圖3-A所示，銨態氮處理條件下茶樹根系細胞膜H+流速率范圍為22.44~68.61?pmol·cm-2·s-1，H+流總量為4?481.73?pmol·cm-2·s-1，比硝態氮處理顯著增加85.31%（圖3-B）。

注：A：茶樹長勢，B：茶樹磷含量

注：A：動態變化，B：均值

注：A：H+流動態變化，B：總H+流

2.4 銨態氮和硝態氮對茶樹根系細胞膜H+-ATPase活性的影響

采用兩相體系（葡聚糖T500和聚乙二醇3350）分離茶樹根系質膜，為驗證茶樹根系細胞膜H+-ATPase純度，分別采用細胞質膜、液泡膜和線粒體膜的專一性抑制劑正釩酸鈉、硝酸鉀和疊氮化鈉進行檢測[23]。

結果表明，正釩酸鈉處理茶樹根系細胞膜H+-ATPase酶活降低約80%，而硝酸鹽和疊氮化鈉處理降低幅度小于10%（圖4-A），說明從茶樹根系膜微囊體中分離得到細胞質膜純度可滿足后續試驗[26]，這與Zhang等[18]的研究結果一致；酶活試驗表明，銨態氮處理條件下，茶樹根系細胞膜H+-ATPase酶活與硝態氮處理相比顯著提高81.60%（圖4-B）；進一步驗證茶樹根系細胞膜H+-ATPase的酶活動力學特征，外源添加不同濃度ATP，結果表明，ATP濃度在2?000~4?000?μmol·L-1范圍內時，細胞膜H+-ATPase酶活均顯著提高，且在ATP濃度為4?000?μmol·L-1時銨態氮處理的茶樹根系細胞膜H+-ATPase酶活性達到最高（3.081?4?μmol·L-1·mg-1·min-1）（圖4-C）。

2.5 茶樹根系細胞膜H+-ATPase的蛋白免疫印跡分析

Western-blot試驗結果表明，銨態氮處理條件下的根系細胞膜H+-ATPase條帶顯著深于硝態氮處理（圖5-A），且其蛋白表達量相比于硝態氮處理顯著提高約3倍，達到極顯著差異水平（圖5-B）。

2.6 不同氮素形態調控茶樹根系磷素吸收與細胞膜H+-ATPase的關系

如圖6所示，當正釩酸鈉置于培養介質中時，茶樹在不同氮素形態處理條件下，磷素在植株的富集均顯著減少，分別降低24.71%和26.66%。結果表明，茶樹根系細胞膜H+-ATPase可能參與了銨態氮和硝態氮調控茶樹對磷素的吸收。

注：A：抑制劑對細胞膜H+-ATPase酶相對活性的影響；B：銨態氮和硝態氮對茶樹根系細胞膜H+-ATPase酶相對活性；酶活動力學特征

注：A：蛋白表達，B：相對表達量

圖6 細胞膜H+-ATPase酶抑制劑對銨態氮和硝態氮調控磷素在茶樹植株富集的影響

3 討論

茶樹是我國重要的經濟作物之一，研究其礦質營養元素的吸收對茶產業發展具有重要指導意義。氮和磷是植物生長發育的重要營養物質，土壤中氮素可調控植物對磷素的吸收與富集[26]。茶園施用磷肥可增強茶樹光合作用強度并促進茶樹糖代謝和多酚類化合物的形成，因此，磷素對茶樹生長發育以及茶葉品質具有重要調控作用[27]。

本研究發現銨態氮能夠顯著增強茶樹對磷素的富集（圖1）。Zhu等[28]的研究表明，與硝態氮相比，銨態氮提高了水稻根部細胞壁中果膠甲基化酶活性和果膠含量，從而促進磷素的再利用以及提高了根部和地上部分可溶性磷的含量。植物細胞膜H+-ATPase通過分泌胞內質子而極化膜電位，產生跨膜電動勢，調控植物對礦質營養元素的吸收[29]。本研究通過對比茶樹的銨態氮和硝態氮水培處理，發現與硝態氮相比銨態氮能顯著提高茶樹根系細胞膜H+-ATPase活性（圖4），增強H+流跨膜運輸量（圖3），提升膜電位（圖2），且增強茶樹根系質膜H+-ATPase表達量（圖5）。藥理學試驗表明，質子泵活性抑制劑正釩酸鈉削弱了不同氮素形態對磷素吸收的調控（圖6）。前人研究發現，銨態氮能夠提高水稻根系細胞膜H+-ATPase活性和蛋白表達，且增強植株對磷素的吸收，表明細胞膜H+-ATPase可能參與銨態氮促進水稻根系磷素吸收[25]。類似的土培試驗研究也發現，外源施加銨態氮可促進玉米根部質子的釋放，酸化土壤介質，提高玉米根部磷素的吸收效率[30]及向地上部分轉運的效率[31]。這些與本文研究結果相似，說明不同氮素形態可能通過調控茶樹根系質膜H+-ATPase影響磷素的吸收。

綜上可見，銨態氮促進了茶樹對磷素的吸收；銨態氮處理的茶樹根系細胞膜電位，H+跨膜運輸，H+-ATPase活性和蛋白表達均高于硝態氮處理，且細胞膜H+-ATPase專一抑制劑Na3VO4能顯著降低不同氮素形態下茶樹根系對磷素的吸收量和富集量。茶樹根系H+-ATPase可能參與不同氮素形態調控磷素的吸收。

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The Role of Plasma Membrane H+-ATPase on Nitrogen-regulated Phosphorus Uptake in Tea Plants

CHEN Linmu1, CHEN Jingguang2, WANG Ningning1, ZHANG Xianchen1*

1. State Key Laboratory of Tea Plant Biology and Utilization, Anhui Agricultural University, Hefei 230036, China; 2. Agricultural Genomics Institute at Shenzhen, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Shenzhen 518116, China

Phosphorus is one of the most important mineral elements for plant growth and development, and different nitrogen forms can regulate phosphorus uptake. As is well-known that plant plasma membrane (PM) H+-ATPase plays an important role in nutrition uptake, it may also relate to the different nitrogen-modulated phosphorus uptake. In our study, PM H+-ATPase in tea roots were isolated by two-phase partitioning in aqueous dextranT-500 and polyethylene glycol, and the effect of different nitrogen forms on phosphorus uptake and the characteristic parameters of PM H+-ATPase in tea roots were examined by using non-invasive micro-test technique and Western-blot. It was found that ammonium significantly improved the phosphorus accumulation in tea plants as compared with nitrate nutrition. In addition, less depolarized PM potentials, higher net H+flux, PM H+-ATPase activities and protein levels were found under ammonium treatment than those under nitrate nutrition treatment. Furthermore, vanadate (the PM H+-ATPase inhibitor) significantly decreased phosphorus accumulation in tea plants under ammonium and nitrate nutrition treatments, which further suggests that PM H+-ATPase may be involved in phosphorus accumulation in tea plants regulated by different nitrogen forms.

ammoniacal nitrogen, nitrate nitrogen, phosphorus absorption, PM H+-ATPase, tea plants

S571.1；S154.1

A

1000-369X(2019)06-723-08

2018-12-30

2019-03-13

國家自然科學基金資助項目（341800583）、安徽省自然基金（KJ2017A126）

陳林木，女，碩士，主要從事茶樹栽培方面的研究，1318457907@qq.com。

zhangxianchen360@163.com