血管內皮細胞源外泌體對動脈粥樣硬化大鼠免疫因子的影響

羅雪挺 周 用 蔣滿紅 羅保平

1.湖北中醫藥大學第一臨床學院，湖北武漢 430000；2.湖北中醫藥大學附屬醫院腫瘤科，湖北武漢 430000

動脈粥樣硬化（atherosclerosis，AS）為心血管系統常見慢性炎癥性疾病［1］，其發病機制多源于動脈壁內皮細胞損傷。內皮細胞屬分界細胞，參與炎癥、抗凝、纖溶等作用［2］，在AS 的發生、發展、遷延等各個病程中都發揮著作用，且介導炎癥及氧化應激作用的發生［3］，其功能障礙于AS 發病早期起關鍵性誘發作用［4］。

深入研究發現，反映血管內皮功能的相關因子可以反映AS 的嚴重程度［5］，其病灶呈多量源于血管內皮細胞等不同細胞的外泌體集聚。排泌功能障礙或遭受損傷的內皮細胞會分泌多樣的黏附分子，同時分泌腫瘤壞死因子（TNF-α）介導白細胞，尤其單核細胞直接黏附于內皮，排泌多種炎癥因子如TNF-α、白細胞介素-1（IL-1）、白細胞介素-6（IL-6）等［6］，促進粥樣斑塊形成，而AS 的探索也迎來新思路：對血管內皮相關外泌體功能的探討及損傷修復機制的研究。

Exosomes 為膜性細胞外泌體，形態結構特殊穩定，可經由胞間信號轉導來調控胞間基因表達［7］，本研究試圖探究血管內皮源性exosomes 與血管內皮細胞損傷的關系及在AS 產生機制中所起作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

8 周齡清潔級健康Wistar 大鼠購自湖北省實驗動物研究中心，實驗動物合格證號：42000600017350，生產許可證號：SCXK（鄂）2018-0018，室溫常規飼養，湖北中醫藥大學倫理委員會審核批準動物實驗。采用完全隨機法進行分組，所有動物編1～30 號，從隨機數字表抄錄30 個數字，各數一律除以3，并以余數1、2、3 代表A、B、C，結果分別歸入3 組，以隨機數字表按斜角線抄錄數字除盡，進行均數改組，得到3 組各10 只大鼠，A、B、C 三組分別為對照組、模型組及免疫組。

1.1 試劑

1640 去exosomes 完全培養基（2018-084-17）、PBS（2018-1073BD）購自GIBCO 公司；Recombinant Murine IL-4（2018-09-372）、Recombinant Murine GM-CSF（315-03-72）均購自Pepro Tech 公司；mouse CD54 magnetic microbeads（921-7-03）、PE anti-mouse CD86 antibody（725-09-27）、PE anti-mouse MHC Ⅰantibody（725-09-39）、FITC anti-mouse CD54 antibody（392-04-33）、FITC anti-mouse MHC Ⅱantibody（392-04-56）均購自eBioscience 公司；Exoquick-TC 抽提試劑盒（10A-7-S）、pNpp 底物（796-2018）、PBST：10×PBS 25 mL/Tween-20 125 μL/去離子水225 mL、封閉液：BSA 2.5 g/PBS 250 mL（H-GS-3329）均購自Sigma 公司；生化試劑NaBr/NaCl/EDTA/蔗糖等購自博士得生物科技有限公司。

1.3 主要儀器設備

流式細胞儀（型號：Attune NxT，ThermoFisher 公司）；CO2恒溫細胞培養箱（型號：DSPM-808，江南儀器）；微量移液器及相應Tip：10、100、1000 μL（型號：Ripet-Lite XLS+，Rainin 公司）；全自動生化檢測儀（型號：AU2700，Olympus 公司）；倒置顯微鏡（型號：GX71，Olympus 公司）；臺式水平高速離心機（型號：Centrifuge 5804R，Eppendorf 公司）；超微量分光光度計（型號：Nanodrop ND-1000，Thermo Finnigan 公司）；-80℃冰箱（型號：MDF-192，SANYO Electric Biomedical 公司）。

1.4 方法

1.4.1 血管內皮細胞培養及鑒定 以去內源性exosomes 培養基原代培養Wistar 大鼠血管內皮細胞，分選后接種入35 mm 培養皿（5×106），依次加20 ng/mL粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子（granulocyte-macrophage colony stimulating factor，GM-CSF）、100 ng/mL IL-4，48 h 后加AGE-LDL 20 μg/mL 孵育，20 h 后倒置相差顯微鏡觀察生長情況。流式細胞術鑒定細胞：收取培養后細胞離心10 min（1000 r/min，r=8 cm），棄上清后重懸分管，每管細胞（1×106）分別加入PE antimouse CD54、PE anti-mouse CD86、FITC anti-mouse MHC Ⅰ，FITC anti-mouse MHC Ⅱ，4℃下避光孵育35 min，3 mL PBS 洗滌2 次，350 μL PBS 重懸處理后的內皮細胞，上機檢測。

1.4.2 Exosomes 的提取制備及鑒定 Ox-LDL 誘導內皮細胞釋放exosomes 并集取，離心10 min（1000 r/min，r=8 cm）后棄上清，接種于35 mm 去內源性exosomes的1640+10%FBS 培養基中（5×106），24 h 后聚集培養液離心10 min（1000 r/min，r=8 cm），集上清轉培養至15 mL 離心管離心15 min（3000 r/min，r=8 cm），再集上清至另一離心管，加Exoquick-TC（比例5∶1），混勻4℃孵育12 h，混懸液離心30 min（1500 g）至漸現白色沉淀，棄上清離心5 min（1500 r/min，r=8 cm），同步驟吸棄上清獲管底沉淀，適量PBS 重懸抽提exosomes 鑒定，余凍存-80℃冰箱。

配制蛋白BCA 工作液形成定量標準曲線（30～500 μg/mL），取80 μL 加入10 μL exosomes 液，混勻后室溫孵育30 min，nanodrop 測OD 值計算濃度；5 μg exosomes 移入1.5 mL 離心管，加10 μL Latex Beads混勻孵育15 min，適量PBS 配至1 mL，振蕩2 h 加110 μL 1 mol/L 甘氨酸，離心混合液3 min（4000 r/min，r=8 cm），棄上清重懸，重復操作，400 μL PBS 重懸后移入4 個試管（每管100 μL），分別加入PE-anti CD86、FITC anti-mouse MHC Ⅰ、PE anti-CD54、FITC antimouse MHC Ⅱ流式抗體，4℃下避光孵育30 min，加PBS 1 mL 離心3 min（4000 r/min，r=8 cm），雙次洗滌，200 μL PBS 重懸后上機檢測。

1.4.3 動物造模 對照組大鼠常規飼養，模型組及免疫組按照固定配比［8］（7%豬油、5%膽固醇、3%白砂糖、0.5%膽酸鈉、0.2%丙硫氧嘧啶、84.3%基礎飼料）配置高脂高糖飼料進行飼養，同時700 000 U/kg 維生素D3灌胃，免疫組于第5 周尾靜脈注射exosomes，繼續喂養至第8 周。

1.4.4 實驗動物生化指標檢測 三組大鼠均只供水12 h稱重，2%戊巴比妥鈉0.2 mL 腹腔注射麻醉，下腔靜脈取血搖勻，離心機離心5 min（3200 r/min，r=8 cm），取上清入AU2700 全自動生化檢測儀，檢測血糖、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）、總膽固醇（TC）、三酰甘油（TG）。

1.4.5 大鼠血管內皮細胞檢測 1.5 mL 血管內皮細胞分離液入離心管，1 mL 肝素抗凝，離心15 min（1800 r/min，r=8 cm）棄上清，保留混懸環狀內皮細胞層，加適量PBS 混勻后離心5 min（1300 r/min，r=8 cm），棄上清留次層細胞混懸，入血細胞計數池，光鏡下九宮格計數血管內皮細胞，同一標本取5 次均值記錄。另取次層細胞混懸100 μL 以500 μL 多聚甲醛固定（4℃），10 min 后分離50 μL 備測細胞混懸于專用EP 管內，加2 μL 抗Ⅷ因子-FITC 抗體混勻，避光孵育30 min（37℃），PBS 混勻離心5 min（1300 r/min，r=8 cm），棄上清，50 μL PBS 重懸，熒光顯微鏡下觀察陽性細胞。

1.4.6 實時熒光定量PCR（qRT-PCR）測定大鼠免疫系統活化情況 檢測IL-2、IL-4、IFN-γ mRNA 水平，引物序列設計及合成由武漢博士德生物科技有限公司完成，引物序列見表1。取大鼠新鮮心血管內皮組織，加RNAiso Plus，按規范操作進行勻漿、脫壁、清洗和孵育，4℃下離心5 min（12 000 r/min，r=8 cm），移入異丙醇及氯仿進行離心，獲取得到總RNA，DEPC 水解沉淀RNA，分別取5 μL 共4 份電泳鑒定。于260～280 nm 波長處以紫外可見光分光光度計檢測吸光度，進行定量換算。繼于PCR 儀上行逆轉錄，反應1 h（42℃）轉入95℃反應5 min，冰上冷卻，繼于95℃加熱1 min，退火30 s，65℃1 min，共40 次循環操作，最后65℃延伸10 min。

1.4.7 免疫組化檢測大鼠免疫系統活化后炎癥因子的表達情況 采集各組大鼠胸主動脈血液，離心勻漿，450 nm 處測OD 值，擬合標準曲線及方程計算各因子濃度，ELISA 雙抗體夾心法檢測各組大鼠血清IL-1、TNF-α、ET-1 的含量，分別以T 細胞受體（TCR）和TLR2、TLR4（Toll 樣受體）作為標記分子，檢測血管壁VCAM-1 的含量。

表1 各指標引物序列及長度

1.5 統計學方法

采用SPSS 11.0 統計學軟件進行數據分析，計量資料數據用均數±標準差（）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD 檢驗；以P ＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 內皮細胞培養及鑒定

2.1.1 MTT 法繪制內皮細胞生長曲線 MTT 法1 周內持續檢測獲得內皮細胞生長曲線，呈現典型的“潛伏-對數生長-平臺”倒S 曲線，傳代至第6 代時可見，細胞進入對數增長期時間較原代略短。見圖1。

2.1.2 倒置相差顯微鏡觀察內皮細胞形態 倒置相差顯微鏡下觀察可見，原代培養的內皮細胞24 h 后緩慢出現并逐漸稀疏、不規則貼壁，單個伸展或簇團均存在，形態、大小有較大差異性，貼壁后生長較緩，對數生長期滯后，72 h 后呈現約80%融合，貼壁漸增，形態漸趨飽滿且規則一致，傳至第6 代，細胞形態較前更為飽滿圓潤。見圖2。

圖1 內皮細胞生長曲線

圖2 鏡下內皮細胞生長情況（400×）

2.1.3 內皮細胞鑒定 經流式鑒定，所得細胞各組陽性率 分 別 為，CD54：93.26%，MHC-Ⅰ：82.57%，CD86：76.79%，MHC-Ⅱ：82.73%。見圖3。

2.2 鑒定exosomes 的純度及屬源性

將抽提獲取得到的exosomes 的血管內皮細胞表達的相關表面分子進行流式分析，CD54 和CD86 表達率分別為18.69%、25.32%，MHC-Ⅰ和MHC-Ⅱ的表達率分別為10.01%、6.98%。見圖4。

2.3 三組大鼠各項生化指標檢測

模型組及免疫組體重均超出正常范圍，模型組與對照組比較，差異有高度統計學意義（P ＜0.01)，相應的各項生化指標血糖、TG、TC、HDL-C、LDL-C 均顯著高于對照組（P ＜0.01），表明造模成功。與模型組比較免疫組各項指標降低，但僅TG、TC 與LDL-C差異有統計學統計學意義（P ＜0.05 或P ＜0.01）。見表2。

2.4 三組大鼠血管內皮細胞免疫熒光計數

對照組大鼠外周血中所含血管內皮細胞數量極少，而模型組大鼠的血管內皮細胞數量明顯增多，而免疫組雖較對照組計數略增，但血管內皮細胞數量少于模型組。見圖5。

圖3 內皮細胞染色情況

圖4 exosomes 純度及屬源性的流式鑒定結果

表2 喂養8 周后三組大鼠各項生化指標比較（）

表2 喂養8 周后三組大鼠各項生化指標比較（）

注：與對照組比較，**P ＜0.01；與模型組比較，#P ＜0.05，##P ＜0.01。TG：三酰甘油；TC：總膽固醇；HDL-C：高密度脂蛋白膽固醇；LDL-C：低密度脂蛋白固醇

2.5 三組大鼠細胞因子檢測

與對照組大鼠比較，模型組大鼠血清細胞因子IL-2、IL-4、IFN-γ 的mRNA 表達均明顯升高，差異有高度統計學意義（P ＜0.01）；與模型組比較，免疫組各項指標均降低，差異有統計學意義（P ＜0.05 或P ＜0.01）。見表3。

圖5 三組大鼠血管內皮細胞免疫熒光計數（熒光免疫，200×）

表3 三組大鼠細胞因子IL-2、IL-4、IFN-γ 的mRNA 表達水平比較（）

表3 三組大鼠細胞因子IL-2、IL-4、IFN-γ 的mRNA 表達水平比較（）

注：與對照組比較，**P ＜0.01；與模型組比較，#P ＜0.05，##P ＜0.01。IL-2：白細胞介素-2；IL-4：白細胞介素-4

2.6 三組大鼠血清炎性因子TNF-α、IL-1、ET-1、NO表達

與對照組比較，模型組大鼠血清炎性因子TNF-α、IL-1、ET-1 水平均明顯升高，血清NO 水平明顯降低，差異均有高度統計學意義（P ＜0.01）；與模型組比較，免疫組TNF-α、IL-1、ET-1 均明顯降低，NO 明顯升高，差異有統計學意義（P ＜0.01）。見表4。

表4 三組大鼠血清炎性因子表達水平比較（）

表4 三組大鼠血清炎性因子表達水平比較（）

注：與對照組比較，**P ＜0.01；與模型組比較，##P ＜0.01。TNF-α：腫瘤壞死因子-α；IL-1：白細胞介素-1；ET-1：人內皮素-1；NO：一氧化氮

3 討論

動脈粥樣硬化的誘因［9］為各種有害因素（血脂、血糖及血壓超標等）導致的血管內皮損傷［10］，舒縮力下降、通透過度及各種功能障礙，各種免疫黏附分子表達異常，導致持續性的內皮損傷［11］，大量促炎因子如IFN-γ、IL-2、IL-4 等釋放入血，內皮下炎癥進行性加劇，脂質浸潤持續增多，最終導致動脈粥樣硬化斑塊成形［12］。可見病程中，內皮細胞損傷與exosomes 分泌互為因果，是關鍵致病因素。

很早就有研究證實預防接種疫苗能有效降低高膽固醇血癥兔的主動脈動脈粥樣硬化斑塊面積［13］，其作用機制多為相應抗原被細胞攝取并加工提呈給周圍淋巴組織，使得機體產生相應的免疫應答，進而消除該抗原的致病作用［14］。現階段動脈粥樣硬化疫苗抗原制備多源于蛋白或肽段，有較多局限性，如易降解、無法凍存、一級過敏反應等［15］。exosomes 依據其獨特的生物學特性與功用在疫苗研究中嶄露頭角［16］。其磷脂雙分子層結構性質穩定，可防止多樣酶降解［17］，且異質性低，有效避免了過敏及排斥反應［18］。因此，exosomes 疫苗具有可觀的發展前景。

ET-1 是源于血管內皮細胞排泌的強力血管收縮肽，具有極強的縮血管和促細胞增殖作用，一旦發生血管內皮損傷，ET-1 的合成與釋放會即時升高，NO亦是血管內皮細胞排泌的內皮保護因子，已證實能阻止動脈粥樣硬化病程進展［19］。本實驗中，模型組大鼠血清的ET-1 水平顯著升高，NO 的水平明顯下降，確定證實病程中的內皮細胞受損，而免疫組ET-1 升高不明顯，差異無統計學意義（P ＞0.05），NO 未明顯下降，提示exosomes 免疫后血管內皮細胞損傷減輕，動脈粥樣硬化病程減緩。

動脈粥樣硬化病程同時與炎性反應密切相關，促炎因子TNF-α、IL-1 則是炎性反應中重要的啟動因子，可促進中性粒細胞對血管壁的黏附及平滑肌細胞增生，活化凝血因子，進而誘發動脈粥樣硬化［20］。動脈粥樣硬化病程中，損傷的血管內皮刺激并活化了免疫系統，細胞因子IL-2、IL-4 和IFN-γ 等相繼釋放。IL-2、IFN-γ 是公認的Th1 反應因子，可以促進單核細胞產生吞噬作用，誘導并加強損傷細胞的細胞毒作用，同時介導細胞漸次排泌TNF-α 與各級氧化因子，識別并殺滅特定靶細胞，IFN-γ 與TNF-α［21］共同導致血管內皮損傷加重。IL-4 源于Th2 細胞排泌，可活化細胞毒性T 細胞，抑制釋放炎性細胞因子，本實驗檢測了各組大鼠外周血清中的IL-2、IL-4、INF-γ mRNA 表達，發現模型組的IL-2、IL-4、INF-γ mRNA 表達較對照組與免疫組都顯著增高；免疫組各項指標的基因表達減弱，這一趨勢在血清炎性因子TNF-α、IL-1 等的表達中亦出現同樣表現，可見，exosomes 免疫后的動脈粥樣硬化大鼠體內，炎性細胞因子排泌表達減少，內皮細胞損傷受到保護，動脈粥樣硬化病程減緩。

綜上所述，exosomes 的獨特的生物學特性及典型的免疫調節作用，在對動脈粥樣硬化病的預防及治療中，將起到不可或缺的作用。