血必凈注射液對(duì)小鼠血液和肺組織中左氧氟沙星分布的影響

郭茂華，楊 輝，姚高瓊△

（1.四川省瀘州市婦幼保健計(jì)劃生育服務(wù)中心，四川 瀘州 646100； 2.重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院，重慶 400016）

目前，臨床治療重癥肺炎的方法主要為抗感染、祛痰、機(jī)械通氣、營(yíng)養(yǎng)支持等，但抗菌藥物長(zhǎng)期大量使用易產(chǎn)生較多的不良反應(yīng)。血必凈注射液聯(lián)合抗菌藥物使用可起協(xié)同作用［1-3］，能改善重癥肺炎患者機(jī)體免疫功能及預(yù)后。血必凈注射液具有解毒散結(jié)、活血化瘀、通經(jīng)活絡(luò)之功效，可改善機(jī)體微循環(huán)，抑制血小板黏附、聚集，改善機(jī)體凝血功能障礙［4-8］。本研究中探討了血必凈注射液聯(lián)合左氧氟沙星（LVFX）靜脈注射后在小鼠血液、肺組織中藥物質(zhì)量濃度的變化情況，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 動(dòng)物、儀器與試藥

1.1 動(dòng)物

SPF級(jí)KM小鼠108只，雌雄各半，體質(zhì)量為18～22g，由重慶醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)為 SCXK（渝）2012-0001。

1.2 儀器

SPD-20A型高效液相色譜儀，包括紫外檢測(cè)器，自動(dòng)進(jìn)樣系統(tǒng)和Labsolutions工作站（日本Shimadzu公司）；R81型高速冷凍醫(yī)用離心機(jī)（北京白洋醫(yī)療器械有限公司）；MX-S型可調(diào)式混勻儀（大龍興創(chuàng)實(shí)驗(yàn)儀器＜北京＞有限公司；BP61型電子分析天平（德國(guó)Sartorius公司）；組織勻漿機(jī)（江蘇其林醫(yī)用儀器廠）；2E-223590型渦旋器（美國(guó)Scientific公司）。

1.3 試藥

血必凈注射液（天津紅日藥業(yè)股份有限公司，批號(hào)為 1709052，規(guī)格為每支 10 mL）；LVFX（上虞京新藥業(yè)有限公司，批號(hào)為 DK24-1707062-Ⅵ，純度為80.6%）；環(huán)丙沙星對(duì)照品（CF，中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)為130451-201203，含量84.2%）；0.9%氯化鈉注射液（西南藥業(yè)有限公司，批號(hào)為18011028，規(guī)格為每瓶500 mL）；甲醇為色譜純，二氯甲烷為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：InertSustainC18柱（150 mm ×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：甲醇-0.02 mol/L磷酸鹽緩沖液（30∶70，V/V，pH3.15）；流速：1mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：290nm；柱溫：30℃；進(jìn)樣量：10 μL；內(nèi)標(biāo)：環(huán)丙沙星（臨配 33.6 μg/mL）。

2.2 樣品采集

將108只小鼠隨機(jī)分為實(shí)驗(yàn)組（血必凈注射液聯(lián)合LVFX）及對(duì)照組（0.9%氯化鈉注射液聯(lián)合LVFX），各54只，雌雄各半。兩組小鼠分別腹腔注射血必凈注射液（22 mL/kg）或等體積0.9%氯化鈉注射液，末次腹腔注射1 h后均靜脈注射LVFX（132 mg/kg，1.32%）。靜脈注射 3，5，10，30，60，120，240，480，720 min后將各組小鼠分為9組，各6只。分別于各時(shí)間點(diǎn)采集血液和肺組織，血液經(jīng)肝素抗凝，取血漿；肺組織稱定質(zhì)量，勻漿，均置-20℃保存。血必凈注射液成人1 d常規(guī)劑量為100 mL，小鼠劑量為成人的11倍，則為22 mL/kg；左氧氟沙星成人治療肺部感染1 d劑量為600 mg，折算成小鼠劑量為132 mg/kg。

2.3 樣品處理

血樣：取小鼠血漿 100 μL，加 33.6 μg/mL CF40 μL，二氯甲烷 800 μL，渦旋提取 1 min，12 000 r/min離心10 min，靜置分層，取下層有機(jī)相600 μL；殘液中加二氯甲烷 800 μL，渦旋提取 1 min，12 000 r/min離心10 min，取下層有機(jī)相600 μL；合并2次提取液，氮?dú)獯蹈?，以甲?200 μL 復(fù)溶，12 000 r/min 離心 10 min，取上清液10 μL測(cè)定藥物質(zhì)量濃度。肺組織：取小鼠肺組織勻漿200μL，加 33.6μg/mLCF40μL，二氯甲烷 1.5mL，渦旋提取1 min，12 000 r/min離心10 min，靜置分層，取下層有機(jī)相1 mL；殘液中加二氯甲烷1.5 mL，渦旋提取1 min，12 000 r/min 離心 10 min，取下層有機(jī)相 1 mL；合并2次提取液，氮?dú)獯蹈?，以甲?00μL復(fù)溶，12000r/min離心10 min，取上清液10 μL測(cè)定藥物質(zhì)量濃度。

2.4 方法學(xué)考察

專屬性試驗(yàn)與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)：在擬訂色譜條件下，小鼠血漿、肺組織勻漿中LVEX的保留時(shí)間均為5.5 min左右，內(nèi)標(biāo)CF保留時(shí)間為7.5 min左右，二者峰形良好，不受血漿和組織勻漿中內(nèi)源性物質(zhì)干擾，藥物及內(nèi)標(biāo)達(dá)基線分離，分離度良好（R＞2.7）。詳見(jiàn)圖1。

線性關(guān)系考察：在空白血漿和肺組織勻漿中添加LVFX，使其質(zhì)量濃度分別為 0.05，0.10，0.50，1.00，2.00，4.00，8.00，16.00，20.00 μg/mL，0.08，0.15，0.30，0.60，1.20，2.50，5.00，10.00 μg/mL，依法處理，按擬訂色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。以LVFX質(zhì)量濃度（X，ng/mL）為橫坐標(biāo)、峰面積（Y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得血漿和肺組織勻漿中LVFX的回歸方程分別為Y1=0.237 8X-0.004 4（r1=0.998 9，n=9），Y2=0.189 6X-8.840 3 ×10-4（r2=0.997 1，n=8）。結(jié)果表明，血漿和肺組織勻漿中LVFX的質(zhì)量濃度線性范圍分別為 0.05～20 μg/mL 和 0.08～10 μg/mL。

定量限與檢測(cè)限考察：在空白血漿和肺組織勻漿中添加 LVFX，使其質(zhì)量濃度約為 0.05 μg/mL和0.02 μg/mL，倍比稀釋，并按擬訂色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，以信噪比（S/N）10∶1和3∶1分別計(jì)算定量限、檢測(cè)限。結(jié)果血漿和肺組織勻漿中LVFX的檢測(cè)限分別為0.05μg/mL和0.02μg/mL，定量限分別為0.050μg/mL和0.080 μg/mL，其回歸方程在所測(cè)質(zhì)量濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。最低定量質(zhì)量濃度分別為50 ng/mL（n=3）和 80 ng/mL（n=3），RSD均小于 10%，符合生物樣本的測(cè)定要求。

圖1 高效液相色譜圖

精密度試驗(yàn)：以空白配置成低、中、高質(zhì)量濃度的供試品（血漿：1，4，16 μg/mL；肺組織勻漿：0.3，1.2，5.0 μg/mL），各3份，按擬訂色譜條件連續(xù)進(jìn)樣測(cè)定6次，記錄峰面積。結(jié)果血漿和肺組織勻漿中LVFX峰面積的RSD均小于7.1%（n=6），表明儀器精密度良好。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：取上述供試品適量，反復(fù)冷凍（-20℃）、融化（60℃內(nèi)）3次；分別于4℃條件下和室溫下放置24 h；于室溫下放置2，10 h時(shí)按擬訂色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。結(jié)果血漿和肺組織勻漿中LVFX峰面積的RSD均小于8.0%（n=6），表明供試品在上述條件下均基本穩(wěn)定。

提取回收試驗(yàn)：同“精密度試驗(yàn)”項(xiàng)下方法操作，記錄峰面積并計(jì)算提取回收率。結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 提取回收試驗(yàn)結(jié)果（n=9）

2.5 藥物質(zhì)量濃度及藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)

采用DAS 2.0藥代動(dòng)力學(xué)分析軟件計(jì)算藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)。采用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析，計(jì)量數(shù)據(jù)以表示，行t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。靜脈注射LVFX后血漿和肺組織勻漿藥物質(zhì)量濃度見(jiàn)表2，藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)見(jiàn)表3。

3 討論

檢測(cè)LVFX在血漿和組織中的藥物質(zhì)量濃度可采用高效液相色譜（HPLC）-熒光法、高效液相色譜-紫外吸收光譜（HPLC-UV）法或氣相色譜 -質(zhì)譜聯(lián)用（LC-MS）法。本研究中參照羅成等［9］的研究，采用HPLC-UV法檢測(cè)LVFX質(zhì)量濃度，以CF為內(nèi)標(biāo)，相同波長(zhǎng)下各種物質(zhì)的出峰互不干擾，檢測(cè)結(jié)果穩(wěn)定可靠。一次進(jìn)樣，約8 min完成，省時(shí)省力。

表3 小鼠血液和肺組織勻漿中藥代動(dòng)力學(xué)參數(shù)（X ± s，n=6）

表2 小鼠血漿和肺組織勻漿中藥物質(zhì)量濃度（X ± s，μg/mL，n=6）

當(dāng)前，根據(jù)各類抗菌藥物對(duì)細(xì)菌的殺菌活性大致分時(shí)間依賴型和濃度依賴型，前者藥物質(zhì)量濃度超過(guò)細(xì)菌最低抑菌濃度（MIC）4～5倍以上時(shí)殺菌活力不再增強(qiáng)，如 β-內(nèi)酰胺類、部分大環(huán)內(nèi)酯類、酰胺醇類等，其評(píng)價(jià)指標(biāo)為藥物濃度高于MIC的時(shí)間（T＞MIC）和半衰期（t1/2）；后者殺菌活力在很大范圍內(nèi)隨藥物質(zhì)量濃度的增加而增強(qiáng)，其評(píng)價(jià)指標(biāo)為AUC0→24h/MIC［即抑菌曲線下面積（AUIC）］和峰質(zhì)量濃度（Cmax）/MIC，屬于此類者有氨基苷類、氟喹諾酮類及硝咪唑類等。LVFX治療嚴(yán)重感染時(shí)與AUIC密切相關(guān)。本研究結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組小鼠肺組織的AUC0→12h，顯著高于對(duì)照組。肺部細(xì)菌感染常見(jiàn)菌為對(duì)耐甲氧西林金黃色葡萄球菌、肺炎球菌、銅綠假單胞菌［10］，臨床分離株對(duì)LVFX的MIC50分別為 0.31，0.62，1.25 mg/L，而MIC90分別為 0.62，1.25，2.50 mg/L，氟喹諾酮類藥物對(duì)革蘭陰性桿菌的AUIC應(yīng)至少為125SIT-1h，對(duì)革蘭陽(yáng)性球菌為30SIT-1h（SIT為血清抑制滴度）［11-12］。因本研究中LVFX給藥劑量為成人治療重癥肺炎時(shí)常用劑量600 mg（每日1次），結(jié)果表明，在12 h內(nèi)兩組均超過(guò)要求，但實(shí)驗(yàn)組超過(guò)更多；同時(shí)可推導(dǎo)，血必凈注射液與LVFX聯(lián)用，需減少LVFX的用量。這對(duì)于降低當(dāng)前氟喹諾酮類的用量、提高治療的敏感性及減少耐藥具有重要意義。

此外，血必凈還可改變LVFX的組織分布。實(shí)驗(yàn)組LVFX廣泛分布于外周組織中，血漿質(zhì)量濃度較低，而對(duì)照組則較少分布在組織中，LVFX質(zhì)量濃度低于實(shí)驗(yàn)組，表明血必凈同LVFX聯(lián)用可產(chǎn)生協(xié)同作用，與其改變藥物的分布有一定關(guān)系。

血必凈提高LVFX在肺組織中的質(zhì)量濃度，可能與其組分中紅花、赤芍、當(dāng)歸、川芎、丹參等成分有關(guān)。該類藥物均具有活血化瘀、扶正祛邪、通經(jīng)活絡(luò)、行氣活血作用，從而改善微循環(huán)，使發(fā)炎的組織通透性改變，痙攣的血管擴(kuò)張，使血流動(dòng)力學(xué)發(fā)生改變。

綜上所述，血必凈注射液可降低LVFX在血液中的質(zhì)量濃度，而升高其在肺組織中的質(zhì)量濃度。