龍膽總苷對肝纖維化模型大鼠相關指標的改善作用

湯小林 ，章俐俐 ，瞿 萍

（1.江西省兒童醫院，江西 南昌 330006； 2.南昌大學藥學院，江西 南昌 330006）

肝纖維化（HF）是各種因素誘發肝損傷時，在肝臟自我修復過程中出現的一種正常的生理病理過程，主要表現為細胞外基質（ECM）大量沉積，肝纖維化狀況可作為評價肝病嚴重程度的重要指標［1-3］。肝纖維化可被抑制，甚至能逆轉，及時干預可有效減少各種嚴重肝臟疾病的發生、發展［4］。龍膽為龍膽科植物條葉龍膽Gentiana manshuricaKitag.、龍膽Gentiana scabraBge.、三花龍膽Gentiana trifloraPall. 的干燥根或根莖［5］，具有清熱燥濕、瀉肝膽火的功效。現代藥理學研究證實，龍膽具有保肝、抗炎、鎮痛、解熱、抗病毒、抗腫瘤等作用［6-8］。龍膽總苷系從龍膽中提取純化所得的有效成分。本研究中擬考察龍膽總苷對四氯化碳（CCl4）誘導的肝纖維化模型大鼠肝纖維化相關指標的影響，探討龍膽總苷抗肝纖維化的作用機制。現報道如下。

1 材料與方法

1.1 動物、儀器與試藥

動物：清潔級SD大鼠60只，雄性，體質量為（180±20）g，購于湖南斯萊克實驗動物有限公司，合格證號為 SCXK（湘）2011-0003。于溫度20～25℃、相對濕度45%～50%環境中適應性喂養1周。

儀器：TGL-27M型臺式高速冷凍離心機（上海高致精密儀器有限公司）；BS124S型電子分析天平（德國Sartorius公司）；CX-31型光學顯微鏡（日本Olympus公司）；Chemix-180型全自動生化分析儀（日本Sysmex公司）；UV-2550型紫外分光光度計（日本 Shimadzu公司）；RM2016型輪式石蠟切片機（奧地利 Leica公司）等。

試藥：龍膽總苷（自制，含量＞85%）；秋水仙堿（湖北帝鑫化工制造有限公司，批號為201703110）；CCl4（西隴化工股份有限公司，批號為2017120312）；丙氨酸氨基轉移酶（ALT）試劑盒（批號為20161224），天門冬氨酸氨基轉移酶（AST）試劑盒（批號為 20161219），白蛋白（Alb）試劑盒（批號為 20170709），總膽紅素（TBil）試劑盒（批號為20170218），均購自南京建成生物有限公司；羥脯氨酸（Hyp）試劑盒（批號為 20170522），透明質酸（HA）試劑盒（批號為 20170406），Ⅲ型膠原（COL Ⅲ）試劑盒（批號為20170423），超氧化物歧化酶（SOD）試劑盒（批號為 20170319），丙二醛（MDA）試劑盒（批號為20170606），轉化生長因子 β1（TGF- β1）試劑盒（批號為20170518），均購自上海森雄生化科技有限公司；食用大豆油為市場購買。

1.2 方法

分組、建模及給藥：將60只大鼠隨機分為正常對照組（A組，等體積0.9%氯化鈉溶液），模型組（B組，等體積0.9%氯化鈉溶液），秋水仙堿組（C組，0.25mg/kg），龍膽總苷高、中、低劑量組（D1組、D2組、D3組，100，60，20 mg/kg），各10只。除A組外，其余各組大鼠均腹腔注射 15%CCl4油溶液（4 mL/kg），首劑加倍，每周 2次，連續8周。建模當天，各組大鼠均開始灌胃給予相應藥物，每天1次，連續8周。

肝功能指標檢測：末次給藥后，大鼠禁食12 h，稱定體質量后腹腔注射2%戊巴比妥鈉（20 mg/kg），尾靜脈取血，12 000 r/min離心10 min，取血清，以全自動生化分析儀測定 ALT，AST，TBil水平。

肝纖維化指標檢測：取上述血清，以酶聯免疫吸附（ELISA）法檢測 TGF-β1，HA，COL Ⅲ水平。

肝損傷及氧化應激指標檢測：上述大鼠取血清后，處死，取適量肝右葉組織，用0.9%氯化鈉溶液漂洗，濾紙拭干后稱定質量，置燒杯后剪碎，倒入勻漿管，肝組織經充分勻漿，3 000 r/min離心15 min，取上清液，按試劑盒方法測定Hyp，MDA，SOD水平。

組織病理學檢查［9-10］：取大鼠肝組織，切成適宜大小，用10% 福爾馬林液固定，脫水，透明，石蠟包埋，切片，蘇木素-伊紅（HE）染色，置光鏡下觀察大鼠肝組織病理學情況。

1.3 統計學處理

采用SPSS 18.0統計學軟件分析。數據以表示，行方差分析。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 對模型大鼠血清肝功能的影響

與A組比較，B組大鼠血清中ALT，AST，TBil水平均顯著升高（P＜0.05）；與 B組比較，C組及D1組、D2組、D3組大鼠血清中ALT，AST，TBil水平均顯著降低（P＜0.05）。詳見表 1。

表1 各組大鼠血清中ALT，AST，TBil水平比較（X ± s，n=10）

2.2 對模型大鼠血清肝纖維化程度的影響

與A組比較，B組大鼠血清中HA，COLⅢ，TGF-β1水平均顯著升高（P＜0.05）；與B組比較，C組及D1組、D2組、D3組大鼠血清中 HA，COL Ⅲ，TGF-β1水平均顯著降低（P＜0.05）。詳見表2。

表2 各組大鼠血清中HA，COLⅢ，TGF-β1水平比較（X ± s，n=10）

2.3 對模型大鼠肝損傷及氧化應激情況的影響

與A組比較，B組大鼠肝組織勻漿中Hyp和MDA水平顯著升高，SOD水平均顯著降低（P＜0.05）；與B組比較，C組及D1組、D2組、D3組大鼠肝組織勻漿中Hyp和MDA水平顯著降低，SOD水平均顯著升高（P＜0.05）。詳見表 3。

2.4 對模型大鼠肝組織病理學的影響

A組大鼠肝細胞未見明顯變性，無炎性反應、脂肪變性及纖維組織增生；B組大鼠肝組織出現明顯病變，肝細胞排列紊亂、無序，胞質內充滿大小不一的脂滴空泡，伴炎性細胞浸潤，出現大量纖維組織增生；C組大鼠肝細胞伴少量小型空泡，有點狀壞死，肝組織內纖維化增生程度及炎性反應較輕；D1組大鼠肝細胞體積有所增大，胞漿疏松化，伴少量小型空泡，少量點狀壞死，炎性細胞浸潤；D2組大鼠肝細胞胞漿疏松化，有少量點狀壞死，伴炎性細胞浸潤；D3組大鼠肝細胞胞質內有脂滴空泡，可見大量淋巴細胞浸潤及纖維組織增生。詳見圖1。

表3 各組大鼠肝勻漿中Hyp，SOD，MDA水平比較（X ± s，n=10）

圖1 肝組織病理學切片（HE，×400）

3 討論

傳統中醫藥治療肝纖維化有一定優勢，并涌現了諸如柴胡、龍膽、杠板歸、黃芪、丹參等中藥及柴胡鱉甲湯、茵陳蒿湯等復方，故闡明傳統中醫藥治療肝纖維化的作用機制對其臨床推廣具有重要意義。建立與人的肝纖維化發生、發展具有相似性的動物模型是探討藥物作用機制的前提條件，以CCl4誘導大鼠肝纖維是較成熟的模型，具有操作簡便、成本較低、耗時較短、重復性較好等優點［11-12］。

ALT，AST，TBil水平可直接反映肝功能狀況［13］。本研究結果顯示，B組大鼠血清中ALT，AST，TBil水平顯著升高，表明肝功能受損，C組及D1組、D2組、D3組血清中ALT，AST，TBil水平均明顯降低，表明各藥物可改善肝功能。

HA，COLⅢ，TGF-β1是肝纖維化重要標志物，HA和COLⅢ水平異常上升會導致ECM合成增加，分解減慢，致使ECM過度沉積；TGF-β1是肝臟受損時產生的主要細胞因子之一，能激活肝星狀細胞（HSC），刺激ECM大量合成［14］。本研究中，B組大鼠血清中HA，COLⅢ，TGF-β1水平均異常升高，各給藥組則出現不同程度下降，提示龍膽總苷可能通過降低HA，COLⅢ，TGF-β1水平實現抗肝纖維化的作用。

正常大鼠肝組織Hyp含量較低，肝損傷模型大鼠肝組織Hyp含量明顯增加，Hyp含量可直接反映肝損傷程度［15］。本研究中，模型大鼠Hyp含量顯著升高，各給藥組均不同程度下降，表明龍膽總苷可能通過降低Hyp含量預防肝損傷。

CCl4經肝細胞代謝激活后，產生的大量自由基會攻擊肝細胞膜上的磷脂分子，引發脂質過氧化反應，產生MDA，破壞細胞膜的結構和功能，從而損傷肝細胞［16］。模型組大鼠MDA含量顯著升高，各給藥組大鼠肝組織勻漿MDA含量不同程度降低，可見，龍膽總苷抗肝纖維化作用與其抗脂質過氧化反應密切相關。SOD可清除過氧自由基，緩解肝損傷，而肝損傷大鼠的SOD含量下降，清除過氧自由基的能力亦降低。本研究結果顯示，龍膽總苷能提高SOD含量，增強清除氧自由基的能力。

綜上所述，龍膽總苷對肝纖維化模型大鼠各項指標均有較好的改善作用，其作用機制可能與龍膽總苷能改善脂質代謝、清除肝臟脂質蓄積、增強肝細胞抗氧化能力、抵御肝細胞的氧化應激和過氧化的綜合作用相關。