子宮內膜癌患者血清miR-205檢測方法的建立*

李 軍，蔡 虎

（1.陜西省藥品技術審核查驗中心，陜西 西安 710065； 2.陜西省醫療器械質量監督檢驗院，陜西 西安 712046）

MicroRNA（miRNA）是一種內源性非編碼單鏈小分子RNA，其5′端為磷酸基團、3′端為羥基基團，長度為21～25個核苷酸。miRNA主要通過結合mRNA來抑制蛋白翻譯過程或酶解切割mRNAs來調控基因的表達［1］。最新研究表明，miR-205在許多類型的癌癥中均異常表達，如頭頸部腫瘤、鱗狀細胞癌、膀胱腫瘤和子宮內膜癌等［2-4］。子宮內膜癌為最常見的婦科腫瘤，占婦科惡性腫瘤的20%～30%，嚴重威脅女性健康。子宮內膜癌好發于絕經后婦女，但近年來發病人群有年輕化趨勢，且其發病率不斷上升。本研究中建立了熒光定量聚合酶鏈式反應（RT-PCR）法，檢測miR-205在子宮內膜癌患者血清中的表達，探討能否將miR-205作為新的腫瘤標志物，用于子宮內膜癌的早期診斷。現報道如下。

1 材料與方法

1.1 樣本血清、儀器與試劑

樣本血清：以擇期行婦科手術的8例子宮內膜癌患者為試驗組，年齡36～65歲，平均44歲；以10例健康者為健康對照組，年齡38～52歲，平均45歲。上述研究對象均取外周靜脈血3mL，常規分離血清，于-80℃貯存。

儀器：CFX384型熒光定量聚合酶鏈式反應（RTPCR）儀（美國BioRad公司）；DU 700型紫外分光光度計（美國Beckman Coulter公司）；CT15RE型高速冷凍離心機（日本Hitachi公司）；MDF-U5412型-80℃低溫冰箱（日本 Sanyo公司）；MX-S型渦旋振蕩器（美國Sciloge公司）；EPOCH型酶標儀（美國BioTek公司）。

試劑：Trizol（日本 Takara 公司，批號為 9108）；miR-205，U6 Primer（廣州銳博生物科技有限公司）；逆轉錄試劑和 SYBR Green PCR reagents（日本Toyobo公司）；C反應蛋白酶聯免疫吸附（ELISA）試劑盒（上海雅吉生物科技有限公司，批號為XS01804）；基質金屬蛋白酶2（MMP-2）ELISA試劑盒（上海戶實醫藥科技有限公司，批號為HS3345）；氯仿、異丙醇、無水乙醇、焦碳酸二乙酯（DEPC）、水（華美生物工程有限公司）。

1.2 方法

總RNA的提取：取樣本血清300 μL，加入Trizol試劑1 mL，振蕩裂解細胞，室溫靜置30 min；加入氯仿200 μL 混勻，冰置 10 min。4 ℃下，12 000 r/min離心10 min；取上清液 200 μL，加異丙醇 200 μL，上下顛倒混勻，冰置 15 min；4 ℃下，12 000 r/min 離心 10 min；棄上清液，加DEPC水1 mL配制的75%乙醇混勻，4℃下，12 000 r/min離心10 min；棄上清液，冰上晾干5～10 min，加入 DEPC 水 20～30 μL 溶解 RNA。在 260 nm和280 nm波長處檢測吸光度（OD）值，確定RNA的純度和濃度。

cDNA的合成：逆轉錄反應體系為20 μL，5×逆轉錄緩沖液 4 μL，dNTP 0.75 μL，miR-205 逆轉錄引物1.2 μL，M-MLV 逆轉錄酶 0.2 μL，總 RNA 樣本 5 μL，DEPC 水 8.85 μL。反應條件為 16 ℃、30 min，42 ℃、30 min，85 ℃、5 min。

血清中miR-205含量的檢測：PCR反應體系（10 μL）為 SYBR 5 μL，上下游引物各 0.4 μL，cDNA 模版 1 μL，Taq DNA 聚合酶 0.1 μL，DEPC 水 3.1 μL。反應條件為95℃預變性3 min，95℃變性12 s，62℃退火50 s，循環40次。反應結束后，定量分析PCR獲得的熔解曲線和擴增曲線的可靠性，并設定循環閾值（Ct），以miR-205/Ub比值代表其相對表達水平，2-△△Ct法計算其相對表達量。

血清中CRP和MMP-2含量的檢測：取樣本血清適量，各孔加入相應待測樣本血清40 μL及抗CRP和MMP抗體10 μL，每孔加入辣根過氧化物酶標記的檢測抗體50 μL，以封板膜封住反應孔，37℃孵育1 h；棄上清液，重復洗5次；每孔加入底物 A、B各50 μL，37℃避光孵育15 min；每孔加入終止液50 μL，15 min內用酶標儀測定在450 nm波長處的OD值。以OD值代表其相對含量。設立對照孔。

1.3 統計學處理

采用Graphpad Prism 5統計學軟件分析。

2 結果

2.1 樣品純度

樣品總 RNAOD260/OD280在 1.8～2.0之間（見表1），表明提取純度較好，RNA幾乎無降解，可進行下一步的實時熒光定量PCR。

表1 樣品總RNA質量濃度（ng/μL）

2.2 引物特異性

miR-205和U6的熔解曲線峰值單一，未見其他雜峰信號；miR-205熔解溫度為75.4℃，U6熔解溫度為80.3℃（見圖1）。說明本試驗中設置的RT-PCR參數合理，miR-205、U6逆轉錄引物和擴增引物能成功擴增出對應的片段，產物特異性較好，試驗結果較可靠。

2.3 miR-25表達水平

健康對照組產生微弱的非特異性信號，且明顯滯后于試驗組。試驗組患者血清中miR-205的表達水平顯著高于健康對照組（P＜0.05）。詳見圖2。

2.4 CRP和MMP-2含量

試驗組患者血清CRP的含量為5.367 mg/L，顯著高于健康對照組的 2.432 mg/L（P＜0.05），兩組的MMP-2含量無顯著差異（P＞0.05）。詳見圖3。

圖1 熔解曲線

圖2 miR-205表達水平

圖3 CRP和MMP-2含量

3 討論

子宮內膜癌的發病機制尚未明確，目前尚無有效的預防機制。miRNA是一類非編碼小分子RNA，其通過堿基互補配對結合特異的靶向mRNA，從而抑制靶向mRNA的翻譯或降解靶向mRNA，從而發揮其癌基因或抑癌基因的功能。

有研究利用miRNA芯片技術發現，子宮內膜癌患者的血清中有多個miRNA表達上調，其中miR-205的上調最顯著［5］。也有報道 miR-205和 miR-342可作為診斷三陰性乳腺癌的潛在生物標志物［6］，miR-205通過靶向ZEB1和Ubc13作為腫瘤的放射致敏劑［7-8］。miR-205下調可明顯抑制腫瘤細胞的增殖與遷移，且能促進抑癌基因JPH4的表達，從而抑制子宮內膜癌的發生及發展［3-4］。也有研究發現，在子宮內膜癌細胞抑制靶向Akt-mTOR通路的miR-205，為孕激素受體型子宮內膜癌提供了一種潛在的、新的治療方法［9］，miR-205通過靶向 PTEN 調控人子宮內膜癌［10］。SU 等［11］發現，miR-205通過靶向子宮內膜癌中的抑癌基因ESRRG促進了腫瘤的增殖和侵襲。

本研究中建立了RT-PCR法檢測血清中的miR-205，該方法快速便捷、靈敏度高、特異性好。但由于樣本量較少，今后還需增加樣本量進一步證明該方法的穩定性。同時，本研究中發現CRP在子宮內膜癌患者的血清中異常高表達。由于miR-205與腫瘤浸潤相關，而CRP也與腫瘤浸潤轉移有關，因此推測子宮內膜癌患者miR-205的異常表達可能是由于CRP的高表達引起。由于miR-205在多種腫瘤中存在表達異常，能否通過兩種或多種miRNA聯合診斷子宮內膜癌的設想，也為今后的臨床研究提供了新的思路。