注射用頭孢美唑鈉高分子雜質鑒定方法研究

韓 彬，龐文哲，高燕霞

（河北省藥品檢驗研究院，河北 石家莊 050011）

頭孢美唑鈉是第2代頭孢菌素類半合成抗菌藥物［1］，對革蘭陽性菌和革蘭陰性菌的抗菌效能均良好，廣泛應用于臨床［2-5］，對多種 β-內酰胺酶穩定，體內分布好、不良反應少［6］。研究表明，β-內酰胺類抗菌藥物引發的速發型過敏反應與藥物中存在的高分子聚合物雜質有關［7-8］。頭孢美唑鈉聚合物測定方法收載于2015年版《中國藥典（二部）》［9］，采用分子排阻色譜法（Cef-SEC）對其高分子聚合物進行測定，但實際試驗結果表明，葡聚糖凝膠G-10色譜柱的柱效較低，分離效果較差，峰形拖尾較嚴重，且測定分析時間較長。本研究中建立了以WT-Cef-SEC為色譜柱的高效分子排阻色譜法測定頭孢美唑鈉中的聚合物，該法分離效能高、分析時間短、專屬性強、靈敏度高，并通過在線脫鹽質譜聯用法證明了其結果準確可靠。現報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

高效分子排阻色譜（2D LC/LCMS-IT-TOF）系統，包括LC-20AD型輸液泵（4個），SIL-20AC型自動進樣器，CTO-20AC型柱溫箱，CBM-20A型系統控制器，DGU-20A5型在線脫氣機，SPD-M20A型二極管陣列檢測器（DAD），SPD-20A型紫外檢測器，FCV-12AH型流路選擇閥（3個），FCV-14AH型色譜柱切換閥（2個），離子阱-飛行時間質譜（LCMS-IT-TOF）儀和LC MS solution Ver.3.80色譜工作站（日本島津公司）。

1.2 試藥

注射用頭孢美唑鈉（河北某藥廠，批號分別為18101701，18101702，18101703，規格為按 GsH17N7O5S3計每次0.5 g）；頭孢美唑對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號為130580-201301，含量為86.9%）；乙腈為色譜純，其他試劑均為分析純，水為超純水。

2 方法與結果

2.1 檢測條件

二維液相系統色譜條件：通路1，色譜柱為WT-Cef-SEC 柱（300 mm ×7.8 mm，5 μm），流動相為5 mmol/L乙酸銨溶液 -乙腈（95 ∶5，V/V），流速為 0.6 mL/min，檢測波長為254 nm，柱溫為30℃，進樣量為20 μL。通路2，色譜柱為InertSustainTMC18柱（50 mm×2.1 mm，2 μm），流動相為水 -乙腈（70 ∶30，V/V），檢測波長為254 nm，柱溫為 30℃，流速為0.3 mL/min，進樣量為 20 μL。

質譜條件：電噴霧離子源（ESI），接口電壓4.5 kV，掃描范圍一級質譜為m/z200～1500；自動多級質譜為m/z100～1 000；霧化氣為氮氣（流速為 1.5 L/min），干燥氣為氮氣（流速為10 L/min），碰撞氣為氬氣，脫溶劑管及加熱模塊溫度均為200℃，檢測器電壓1.65 kV，校準方法為自動調諧優化電壓，外標法校準質量數。

2.2 溶液配制

稱取樣品50 mg，精密稱定，置10 mL容量瓶中，加水溶解并定容，搖勻，濾過，作為供試品溶液（臨用新制）；另取頭孢美唑對照品適量，精密稱定，加水制成每1 mL中約含5 μg的對照品溶液。

2.3 系統適用性試驗

取供試品溶液適量，按2.1項下通路1液相色譜條件進樣分析，色譜圖見圖1。高效分子排阻色譜法檢測時，大分子量的化合物先出峰，因此，主峰前的峰為聚合物峰。其中聚合物1含量低于0.05%，聚合物2和聚合物3為頭孢美唑鈉主要高分子雜質。

圖1 頭孢美唑鈉高效液相色譜圖

2.4 聚合物結構鑒定

在2D-LC-IT-TOF/MS系統中，將頭孢美唑鈉主峰切換到LOOP環1中，經通路2液相色譜條件進樣分析，得MS色譜圖和多級質譜圖，詳見圖2和圖3。頭孢美唑鈉相對分子質量493.027 3，一級質譜圖中［M+H］+為m/z494.032 9，與軟件計算理論值m/z494.034 6一致。

將聚合物3切換到LOOP環2中，經通路2液相色譜條件進樣分析，得MS色譜圖和多級質譜圖，詳見圖4和圖 5。一級質譜圖中［M+H］+為m/z987.705 2，是頭孢美唑鈉相對分子質量的2倍，二級質譜圖中m/z495.825 6碎片為聚合位點的酰胺鍵斷裂形成的頭孢美唑鈉單體碎片。

將聚合物2切換到LOOP環3中，經通路2液相色譜條件進樣分析，得MS色譜圖和多級質譜圖如圖6和圖 7。一級質譜圖中［M+H］+為m/z1 480.138 7，是頭孢美唑鈉相對分子質量的3倍。在二級質譜圖中m/z986.686 5碎片為聚合位點的酰胺鍵斷裂形成的頭孢美唑鈉二聚體碎片。

圖2 頭孢美唑鈉離子流圖

圖5 聚合物3多級質譜圖

2.5方法學考察

專屬性試驗：稱取注射用頭孢美唑樣品50 mg，置10 mL容量瓶中，平行5份，分別進行高溫（60℃下放置10 min）、酸破壞（0.1 mol/L HCl 1 mL，放置 1 min，取0.1 mol/L NaOH溶液1 mL中和）、堿破壞（0.1 mol/L NaOH 溶液 1 mL，放置 1 min，取 0.1 mol/L HCl溶液1 mL中和）、強光（3 500 lx強光照射 12 h）、氧化破壞（30%H2O21 mL，放置 1 min）加速破壞操作，按 2.1項下通路1液相色譜條件進樣分析，記錄色譜圖。主峰與以上破壞產生的降解物峰均能獲得良好分離，不干擾聚合物的測定。

圖7 聚合物2二級質譜圖

線性關系考察：取頭孢美唑對照品適量，精密稱定，用水溶解并制成質量濃度分別為0.5，1.0，5.0，10.0，20.0 μg/mL 的系列溶液，取 20 μL，按 2.1 項下檢測條件進樣測定。以峰面積（A）為縱坐標、質量濃度（C）為橫坐標進行線性回歸，得回歸方程A=185.55C-13.213，r=0.999 9（n=5）。結果表明，頭孢美唑質量濃度在0.5～20.0 μg/mL范圍內與峰面積線性關系良好。

定量限和檢測限檢測：取對照品溶液，加水倍比稀釋，按2.1項下檢測條件進樣測定。以信噪比（S/N）為10計，頭孢美唑的定量限為3 ng，以S/N為3計，頭孢美唑的檢測限為1 ng。

精密度試驗：取對照品溶液，按2.1項下檢測條件進樣測定，重復進樣5次。結果的RSD為0.16%（n=5），表明儀器精密度良好。

重復性試驗：取樣品（批號為18101701）50 mg，置10 mL容量瓶中，加水溶解并定容，平行操作6份，按2.1項下檢測條件進樣測定。結果聚合物2和聚合物3平均含量分別為0.2%和0.1%，RSD分別為0.1%和0.3%（n=6），表明方法重復性良好。

2.6 測定方法

因頭孢類聚合物對照品不穩定較難獲得［10-11］，但其聚合物為自身聚合而成，紫外吸收官能團一致，在各種濃度下，聚合物峰與主峰的紫外吸收一致，故聚合物含量的測定均按不加校正因子的主成分自身對照法計算。取3批樣品，分別按2.1項下通路1液相色譜條件及2015年版《中國藥典（二部）》收載的聚合物檢測方法測定。結果見表2。按外標法以峰面積計算，含頭孢美唑鈉聚合物以頭孢美唑計，規定限度為多聚物不得超過0.3%，二聚物不得超過0.5%。

表2 樣品含量測定結果（%，n=3）

3 討論

3.1 在線脫鹽液質聯用技術

本試驗中采用2D-LC-IT-TOF/MS法對注射用頭孢美唑鈉聚合物進行鑒定［12］。該方法基于一組共用的餾分收集環的二維液相質譜聯用系統建立，對目標峰快速分析的同時可完成流動相轉換即脫鹽過程，在不改變原流動相條件的基礎上，實現了液質聯用分析目標雜質，其中通路1液相色譜條件通過時間程序控制自動對分離過程中的目標雜質進行捕集；通路1液相色譜條件分析結束后，批處理自動執行通路2液相色譜條件分析，此時捕集在1個或多個餾分收集環中的雜質組分分批依次通過適合質譜分析的流動相注入通路2液相色譜柱中，可在準確推定檢出雜質結構的同時，又能實現對一維液相色譜條件下色譜圖中各雜質的準確定位。

3.2 色譜柱選擇

文獻資料鍵合球狀蛋白色譜用親水硅膠柱，聚合物峰與主峰之間的分離度有很大改善，但聚合物峰檢出數量少［13-14］。本研究中選擇的 WT-Cef-SEC色譜柱（Sepax公司）采用專利的表面修飾技術，獨有的化學修飾技術可精確控制親水涂層的厚度，聚合物峰與主峰之間的分離度有很大改善，同時具有更寬的耐用性和更強的分離效果，可更好地控制產品質量，為企業改善生產工藝提供了技術支持。

3.3 聚合物峰分析

方法學考察過程中發現，樣品對酸堿極不穩定，對高溫和氧化不穩定，聚合物峰檢出數量明顯增多，提示產品結構容易發生斷裂的位點較多［15］，高分子雜質檢查有助于建立更適宜頭孢美唑鈉生產和儲存的條件。

3.4 與《中國藥典》方法對比

按2015年版《中國藥典（二部）》收載的注射用頭孢美唑鈉聚合物檢查方法進行對比試驗，本方法的進樣量更少，分析時間更短，靈敏度更高，分離度更好，檢出的聚合物更多，能快速、有效、高靈敏地檢出頭孢美唑鈉中的聚合物，同時為 β-內酰胺類其他抗菌藥物品種中聚合物的分離、分析及產品質量提高提供了依據。