外周血淋巴細胞亞群對早期復發性流產妊娠結局的預測價值①

陳藝璇 唐相靖 崔金全

(鄭州大學第二附屬醫院，鄭州 450014)

復發性流產(Recurrent miscarriage，RM)是多種危險因素相互作用的結果[1]。妊娠10周之前發生的RM通常稱為早期RM[2,3]。研究表明早期RM與妊娠期母胎界面免疫失衡及同種免疫功能紊亂相關，淋巴細胞作為重要的自身免疫細胞，在調節同種免疫功能中起到重要作用[4,5]。外周血淋巴細胞亞群增高與RM患者再次發生流產風險的關系存在爭議，因此給臨床診斷和治療造成困惑。本文回顧性研究了RM患者早孕期及非孕期外周血中淋巴細胞亞群百分比的變化，分析淋巴細胞亞群異常與早期RM患者妊娠結局的關系，探討其診斷及預測意義。

1 材料與方法

1.1臨床資料 選取2017年1月至2018年8月于鄭州大學第二附屬醫院進行診療的具有早期RM病史的患者153例作為觀察對象，其中87例早孕女性，年齡21～45歲，平均(31.69±5.53)歲，孕齡26～65 d，平均(48.29±14.25)d，孕次3～7歲，平均(4.14±1.14)次，早期自然流產2～6次，平均(2.74±0.98)次；66例未孕女性，年齡24～41歲，平均(31.99±5.06)歲，孕次2～9次，平均(3.55±1.90)次，早期自然流產2～6次，平均(3.33±1.59)次；選取同期至我院孕前體檢及圍產保健的110例既往無不良妊娠及生產史、無遺傳病家族史、無慢性病史的健康女性作為對照組，其中68例早孕女性，年齡23～42(30.99±4.67)歲，孕齡32～65 d，平均(50.88±11.22)d；42例未孕健康女性，年齡22～40歲，平均(30.52±4.74)歲。早期RM組納入標準：①同一性伴侶；②曾經連續2次或2次以上孕齡<10周自然流產的病史；③就診時孕周<10周。 排除標準：①經陰道超聲或者宮腔鏡檢查確診子宮解剖結構異常；②內分泌異常：糖尿病、甲狀腺功能異常、多囊卵巢綜合征、高泌乳素血癥、高雄激素血癥；③自身免疫抗體陽性：抗核抗體及其提取物、抗心磷脂抗體、抗β2糖蛋白抗體、狼瘡凝集物、抗甲狀腺抗體；④凝血因子異常：蛋白C、蛋白S、抗凝血酶Ⅲ；⑤夫婦雙方染色體異常；⑥其他疾病；⑦男方精液及精子異常。觀察組與對照組在年齡、孕齡一般資料無統計學差異(P>0.05)。

1.2檢測方法 取患者全血50 μl，加入等體積的溶血劑，離心后去上清，分別加入CD3 FITC/CD8 PE/CD45 PerCP/CD4 APC、CD3 FITC/CD16+CD56 PE/CD45 PerCP/CD19 APC 抗體 20 μl (BD MultiTEST IMK Kit)，避光孵育15 min，加100 μl PBS重懸細胞，FACSCaliburTM流式細胞儀檢測CD3+、CD4+、CD8+、CD16+CD56+、CD19+細胞的比率。

2 結果

2.1妊娠結局 87例RM早孕患者中，50例在10周前發生流產，流產率57.47%；68例對照早孕女性中，24例在10周前發生流產，流產率35.29%，二者的流產率差異有明顯的統計學意義(P=0.009 3)。

2.2外周血淋巴細胞百分比的差異比較 與110例健康女性相比，153例RM患者外周血CD3+(T淋巴細胞)、CD3+CD4+(Th細胞)、CD3+CD8+(TS細胞)、CD19+(B淋巴細胞)型淋巴細胞百分比沒有顯著的統計學差異，而CD16+CD56+型淋巴細胞(NK細胞)的百分比(14.26%±5.42%)顯著高于對照組(9.56%±4.68%)，P<0.001(圖1A)。外周血NK細胞百分比ROC曲線分析(AUC=0.737 8)顯示，NK細胞百分比> 17.5%對于RM患者具有高度特異性(94.55%)，敏感度21.57%(95%CI=15.34% to 28.94%),約登指數(Youden index)0.162，似然比(Likelihood ratio)3.954(圖1B)。

圖1 RM組與對照組外周血淋巴細胞細胞百分比差異Fig.1 Differences in peripheral blood lymphocytes between RM group and control groupNote:A.Percentage difference in each subgroup of lymphocytes;B.Analysis of ROC curve of peripheral NK cells.***.P<0.001.

2.3外周血淋巴細胞亞群百分比在不同亞組之間的差異比較 與RM非孕患者相比，有RM病史的早孕患者外周血T淋巴細胞，Th細胞百分比顯著增高(P<0.001),TS細胞百分比差異無統計學意義，NK細胞百分比顯著降低(P<0.001);健康對照女性中，早孕女性外周血T淋巴細胞、TS細胞百分比顯著增高(P<0.001),Th細胞百分比差異無統計學意義，NK細胞百分比顯著降低(P<0.001)。在所有婦女中，孕期NK細胞百分比相對非孕期均顯著降低(P<0.001)。RM非孕患者與對照非孕女性相比，Th細胞百分比較低，NK細胞百分比較高，差異均有統計學意義(P<0.05)。見表1。

表1 復發性流產組及對照組淋巴細胞亞群改變及顯著性比較

Tab.1 Summary of lymphocyte subsets parameter alterations and significance in RMs compared with Controls

RMs(n=153)Non-pregnant(n=66)x±sMedian(Range) Pregnant(n=87)x±sMedian(Range) tPControls(n=110)Non-pregnant(n=42)x±sMedian(Range) Pregnant(n=68)x±sMedian(Range) tPT70.41±8.3673(56,84)74.16±6.6776(57,83)3.9190.000 71.33±5.0272(64,79)75.79±6.5876.5(59,87)4.0580.000 TH35.73±4.4635(32,45)39.06±6.3240(27,51)3.480.000 38.67±8.6839(20,49)38.21±5.1139(27,55)0.4200.674TS28.89±6.1427(19,43)30.10±7.2931(17,48)1.2640.20629.18±6.2725(22,41)32.43±6.6332(20,46)2.9700.003NK15.81±4.9916(6,32)12.67±4.4813(3,32)3.2810.00111.90±4.3210(7,21)8.96±4.788(1,25)2.6870.007B11.29±3.9310(6,19)11.53±4.1511(6,22)0.2510.80211.62±1.8211(10,15)12.71±3.9112(5,24)0.9960.320

2.4外周血淋巴細胞亞群對妊娠結局的影響 RM組流產者與繼續妊娠者相比，外周血T淋巴細胞及B淋巴細胞百分比差異無統計學意義(P>0.05)，NK細胞百分比高于繼續妊娠者，差異具有明顯的統計學意義(P<0.01)。對于對照組女性，流產者與繼續妊娠者淋巴細胞亞群百分比差異均無統計學意義(圖2A)。NK細胞百分比與 RM早孕患者妊娠結局的ROC曲線分析(AUC=0.741 6)顯示(圖2B)，NK細胞百分比> 13.5%對于RM早期流產女性具有高度特異度(86.49%)，敏感度56%(95%CI=41.25% to 70.01%),約登指數(Youden index)0.424 9，似然比(Likelihood ratio)4.144。

圖2 外周血淋巴細胞亞群對妊娠結局的影響Fig.2 Influence of peripheral blood lymphocyte subsets for pregnancy outcomesNote:A.Percentage difference in lymphocyte subsets with different pregnancy outcomes;B.ROC analysis of NK cell percentage for pregnancy outcome in early pregnant patients with RM.**.P<0.01.

3 討論

近年來，免疫型RM的發病率增加[6]。根據免疫類型，RM分為自身免疫型RM和同種免疫型RM。同種免疫型RM分為由NK細胞數量及活性升高、巨噬細胞功能異常、樹突狀細胞功能異常、補體系統異常等引起的固有免疫紊亂及由T/B淋巴細胞異常、Th1/Th2細胞因子異常引起的獲得性免疫紊亂[7]。 越來越多的研究表明母胎界面的淋巴細胞構成的免疫調節網絡在維持正常妊娠中起重要作用[8-12]。

T淋巴細胞是人體主要的CD3+型免疫細胞，根據T淋巴細胞表型的不同，可分為CD3+CD4+輔助型T細胞和CD3+CD8+抑制型(細胞毒性)T細胞。輔助型T細胞通過分泌各種細胞因子，參與體內免疫調控和免疫耐受調節，誘導母胎界面免疫耐受，影響胚胎著床、滋養細胞侵蝕及胚胎正常發育[4,5,13-15]。既往研究表明，未孕RM患者和具有正常生育能力的未孕婦女外周血 T淋巴細胞、Th細胞百分比水平無差異，而TS細胞百分比增加有統計學意義[16]。在本項研究中，RM患者與健康對照女性相比，T淋巴細胞亞群無明顯差異；在所有婦女中，早孕女性的T淋巴細胞百分比均高于未孕女性。有趣的是RM早孕患者以Th細胞百分比增高為主，而正常對照早孕女性以TS細胞增高為主，結果提示復發性流產患者妊娠可能與正常妊娠免疫調節的方向有所不同，主要是以輔助型T細胞百分比增加為主，通過增加其分泌的細胞因子，加強免疫調節，促使及維持妊娠。

NK細胞是一種大顆粒淋巴細胞，對腫瘤細胞和感染細胞具有細胞毒性，同時可以產生各種細胞因子，參與調節適應性免疫反應[17,18]。既往研究表明，外周血NK細胞異常與原因不明的RM有因果關系，并可能參與 RM的病理生理學。NK細胞異常一方面可導致母體固有免疫紊亂，另一方面可攻擊絨毛滋養層細胞，阻礙絨毛侵蝕及母胎循環建立，從而導致流產，而這一現象在正常流產中并不顯著。Ebina等[19]的研究提示外周血NK細胞的活性增加與不明原因的RM相關。且RM子宮NK細胞功能及活性異常，與外周血NK細胞數目增加有關[20]，通過下調外周血NK細胞的百分比能夠改善復發性流產患者的妊娠結局[11]。本研究發現，復發性流產患者NK細胞百分比明顯高于正常對照女性。外周血NK細胞百分比17.5%是一個可以嘗試診斷自身免疫型RM患者NK細胞異常的標準。在King等[21]的研究中比較RM組和對照組之間的NK細胞百分比的ROC分析(AUC=0.706)顯示，NK細胞百分比> 18%對于RM(97.0%)女性具有高度特異性，Hajar Adib Rad等[22]的研究提示復發性流產非孕女性外周血NK細胞百分比相對于正常對照女性增加，在復發性流產患者評估中具有預測價值，本研究結果與之相符。RM患者中，流產患者的NK細胞百分比明顯高于繼續妊娠患者，表明NK細胞百分比增高對復發性流產患者再次妊娠結局有不良影響。ROC曲線分析提示RM患者早孕期NK細胞百分比小于13.5%有良好的妊娠結局。這可能是RM早孕患者是否進行免疫調節治療的新轉折點。 總之，外周血淋巴細胞亞群百分比的異常直接反映了RM妊娠建立中存在著免疫功能紊亂。NK細胞百分比可作為預測RM患者再次妊娠結局的一個潛在指標，為RM患者孕期是否進行免疫治療提供理論依據。然而，NK細胞百分比增高導致流產的病理機制及高NK水平的RM患者的NK水平應控制到多少才會從免疫治療中獲益有待進一步的研究。