葡萄糖調節蛋白78及精漿生化與弱精子癥的相關性研究

韋玉霞　李潔　龐曉霞　廖碧云　陳興鴻　王俊利　陳學杰

【摘要】 目的 探究葡萄糖調節蛋白78（GRP78）和精漿生化指標（果糖和鋅）與弱精子癥的關系。

方法 選取80例弱精子癥不育男性為弱精子癥組，80名有生育史的健康男性為正常對照組，分別采用酶聯免疫吸附法（ELISA）、5-B-PASA顯色法、酶法檢測所有研究對象血清中的GRP78蛋白水平和精漿中的鋅及果糖等指標，分析這三項指標與男性弱精子癥的關系。

結果 弱精子癥患者組的血清GRP78蛋白的表達水平和精漿果糖表達量顯著低于正常對照組，差異有統計學意義（P<0.001），而精漿中的鋅表達量在兩組間比較差異無統計學意義（P>0.05）。輕度弱精子癥組（20%≤PR<32%）、中度弱精子癥組（10%≤PR<20%）和極重度弱精子癥組（PR<10%）的精漿果糖含量和血清GRP78蛋白表達量與正常對照組比較差異有統計學意義（P<0.05），且精漿果糖和血清GRP78含量在正常對照組、輕度弱精子癥組、中度弱精子癥組和極重度弱精子癥組有遞減趨勢。

結論 血清GRP78蛋白以及精漿果糖表達量的檢測有助于弱精子癥的臨床診斷，有可能作為弱精子癥嚴重程度評估的參考指標。

【關鍵詞】 葡萄糖調節蛋白78;果糖;鋅;弱精子癥

中圖分類號：R698+.2 文獻標志碼：A DOI：10.3969/j.issn.1003-1383.2019.11.003

Relationship between glucose regulatory protein 78 and seminal plasma biochemistry and male asthenospermia

WEI Yuxia1，4，LI Jie2，PANG Xiaoxia2，LIAO Biyun4，CHEN Xinghong4，WANG Junli4，CHEN Xuejie1

（1.Guangxi Medical University，Nanning 530001，China;2.Department of Laboratory Medicine of Xingyi Peolples Hostpital，Xingyi 562400，China;3.Graduate School of Youjiang Medical University for Nationalities，Baise 533000，China;4.Reproductive Medicine Center，Affiliated Hospital of Youjiang Medical University for Nationalities，Baise 533000，China）

【Abstract】 Objective To explore the relationship between glucose regulatory protein 78（GRP78） and seminal plasma biochemical indicators（fructose and zinc） and asthenospermia.

Methods 80 infertile men with asthenospermia were selected as asthenospermia group and 80 healthy men with reproductive history as normal control group.ELISA，5-B-PASA and enzymatic methods were respectively used to detect the levels of serum GRP78 protein and the contents of zinc and fructose in seminal plasma for the relationship between indicators and male asthenospermia.

Results The expression level of GRP78 protein in serum and fructose in seminal plasma of asthenospermia patients was significantly lower than that of normal control group，and the difference was statistically significant（P<0.001），but no significant difference was observed in the expression of zinc in seminal plasma between the two groups（P>0.05）.Statistical difference（P<0.05） was also found in the expression of fructose in seminal plasma and GRP78 in serum of mild between normal group and asthenospermia group（32%>PR≥20%），moderate asthenospermia group（20%>PR≥10%） and severe asthenospermia group whose fructose expression in seminal plasma GRP78 in serum showed a tendency of decrease.

Conclusion The detection of GRP78 protein and fructose expression in seminal plasma is helpful for the clinical diagnosis of asthenospermia，and may be used to assess the severity of asthenospermia.

【Key words】 GRP78;fructose;zinc;asthenospermia

不孕不育癥已逐漸成為全球共同關注的健康問題，影響著全球15%～20%的育齡夫婦。這些不孕不育患者中男性因素引起的不育大約占50%，而獲得性和先天性精子異常是男性不育的重要因素[1]。作為精子質量異常最常見的類型，弱精子癥是引起男性不育的主要因素之一。弱精子癥的特征是新鮮精液中的精子數量正常但精子活力降低，可能由泌尿生殖系統感染、精索靜脈曲張異常、精液液化、激素異常等原因引起。葡萄糖調節蛋白78（glucose regulated protein 78，GRP78）又稱為免疫球蛋白重鏈結合蛋白，是熱休克家族的成員。作為一種內質網應激的關鍵伴侶蛋白，GRP78主要參與蛋白質的合成、轉運、折疊，維持蛋白質的正確構象，通過與內質網應激原件的結合抑制內質網應激的活化，對細胞發揮保護作用[2]。近年來，有研究發現GRP78蛋白的異常表達與多種生殖系統疾病的發生發展密切相關[3～5]。我國學者申樹林等[6]研究證實，GRP78蛋白在正常精子中高表達，而在弱精子中低表達。進一步研究表明外源性GRP78作為分子伴侶，可能是通過調節精子細胞內Ca2+水平影響精子的運動。國外學者Visconti等[7]研究認為蛋白質磷酸化是精子獲能相關的細胞內重要條件之一，GRP78可能作為蛋白質磷酸化激活因子通過CAMP信號途徑使精子獲能，認為GRP78是維持精子活力的重要調節因子。在本研究中，我們將探討GRP78血清表達情況和精漿生化水平與弱精癥的相關性，以期為弱精子癥的診斷尋找新的診療靶點。

1 資料與方法

1.1 對象選取

研究對象均來自2018年2～7月右江民族醫學院附屬醫院生殖醫學中心男科病人，以前向運動精子百分率（PR%）<32%、其他精液常規參數正常的不育患者為弱精子癥患者組80例，其未采取避孕措施，婚后性生活正常，不育年限超過1年，排除女方因素。根據WHO《人類精液檢查與處理實驗室手冊》（第5版）精子活力分級標準，以精子PR%為標準對男性精子活力進行分級，其中PR%≥32%為正常對照組，PR%<32%為弱精子癥組，再將弱精子癥患者按PR%大小分為輕度弱精子癥組（20%≤PR<32%）、中度弱精子癥組（10%≤PR<20%）和極重度弱精子癥組（PR<10%）。同時選取同一時期到我院生殖中心男科就診的80名已正常生育且精子前向運動百分率≥32%、精液常規檢查結果正常的健康男性為正常對照組。所有患者均已簽署知情同意書。

1.2 研究方法

1.2.1 精液常規分析

所有研究對象禁欲3～7 d，通過手淫法采集全部精液于干凈的取精杯中，精確測量精液體積，置于37℃水浴孵育。液化后的精液使用西班牙SCA精液分析系統進行常規精液分析，用Diff-Quik快速染色進行鏡下精子形態分析。

1.2.2 精漿生化分析

將精液標本經離心速度為3000 rpm離心20 min，取上層精漿用于生化指標的檢測。精漿中的鋅含量檢測采用5-B-PASA顯色法，果糖含量檢測采用酶法。試劑均來自深圳博銳德公司精漿生化系列檢測試劑盒。儀器使用美國Awareness公司ChemWell2910全自動生化免疫分析儀。

1.2.3 GRP78蛋白的提取

靜脈抽取研究對象外周血3.0 mL，室溫自然凝固10～20 min，以離心速度為3000 rpm離心20 min，分離血清后分裝于干凈試管，置于-20℃冰箱保存備用。

1.2.4 GRP78蛋白含量的檢測

將置于-20℃的血清標本置于室溫自然解凍，后采用酶聯免疫吸附法（ELISA）進行GRP78蛋白的檢測。試劑盒為上海酶聯生物科技有限公司生產，檢測儀器為RT-6000酶標分析儀。

1.3 統計學方法

采用統計學軟件SPSS 17.0對所得實驗數據進行統計分析。計量資料符合正態分布以（±s）表示，兩組之間的比較采用成組t檢驗，不符合正態分布采用秩和檢驗。四組間的數據比較采用單因素方差齊性分析，均數間的多重比較采用SNK法。檢驗水準：α=0.05，雙側檢驗。

2 結果

2.1 研究對象的臨床特征

經統計分析，研究對象中弱精子癥組和正常對照組的平均年齡分別為（34.09±6.18）歲和（33.18±6.46）歲，兩組的精子濃度、精液量、精液pH值均在正常值范圍之內，差異無統計學意義（P>0.05）。正常對照組的精子前向運動百分率、非前向運動百分率高于弱精子癥組，不動精子百分率低于弱精子癥組，比較差異有統計學意義（P<0.001）。見表1。

2.2 精漿鋅、果糖、GRP78蛋白含量在弱精子癥組和對照組的比較

經統計分析，正常對照組的精漿果糖含量和血清GRP78蛋白水平表達量顯著高于弱精子癥組，且兩組間比較差異有統計學意義（P<0.001），而弱精子癥患者精漿鋅含量與正常對照組比較，差異無統計學意義（P>0.05）。見表2。

2.3 不同精子PR%組的精漿果糖、精漿Zn和血清GRP78水平比較

進一步分析正常對照組、輕度弱精子癥組、中度弱精子癥組和極重度弱精子癥組的精漿果糖、鋅和血清GRP78水平，并采用SNK法對組間進行兩兩比較。結果顯示，正常對照組的精漿果糖含量和血清GRP78蛋白表達量均顯著高于輕度、中度和極重度弱精癥組（P<0.05）;而輕度弱精子癥組、中度弱精子癥組和極重度弱精子癥組兩兩比較差異無統計學意義（P>0.05）;精漿Zn含量在正常對照組與輕度、中度以及極重度弱精子癥組兩兩比較，差異無統計學意義（P>0.05）。見表3。且精漿果糖和血清GRP78含量在正常對照組、輕度弱精子癥組、中度弱精子癥組和極重度弱精子癥組有遞減趨勢，即隨著弱精子癥嚴重程度的增加其GRP78蛋白水平有不同程度的下降，如圖1所示。

3 討論

GRP78屬于熱休克蛋白70家族成員之一，作為一種分子伴侶在蛋白質的折疊和轉運過程及內質網應激反應中發揮重要作用。有研究已證實 GRP78在人和小鼠睪丸及附睪中精子發生時期表達[8～10]，且其表達異常可能與男性生殖系統疾病密切相關。在本研究中，我們發現弱精子癥組的血清GRP78蛋白表達量顯著低于正常對照組，與申樹林等[6]研究結果相一致。為驗證GRP78水平是否影響精子活力，本研究參照《WHO人類精液檢查與處理實驗室手冊》（第5版）標準，以精子PR%將研究對象分為四組（正常對照組、輕度弱精子癥組、中度弱精子癥組和極重度弱精子癥組），并分析各組之間血清GRP78蛋白表達水平的差異，結果顯示，正常對照組的血清GRP78蛋白水平明顯高于輕度、中度、極重度弱精子癥組，提示血清GRP78水平可能與弱精子癥發病存在一定關系。此外，我們還發現隨著弱精子癥嚴重程度上升，血清GRP78蛋白含量呈下降趨勢，進一步表明該蛋白可能與精子活力高低有關，提示GRP78可能是維持精子活力的重要調節因子。目前，尚缺乏檢測GRP78蛋白水平的成熟方法。申樹林等[6]用雙向電泳凝膠分析法發現GRP78在正常精子蛋白中高表達、在弱精子癥蛋白中低表達，并采用Western-Blot法進一步證實這一現象，上述方法檢測較繁瑣，且成本較高。本研究參考GRP78在多發性骨髓瘤、鼻咽癌和神經精神系統性紅斑狼瘡等疾病的有關報道[11～13]，采用雙抗體一步夾心法酶聯免疫吸附試驗測定血清樣本GRP78 蛋白水平，該方法操作較簡便且成本低于申樹林等的研究方法，因此，該方法可能適用于科學研究以及臨床應用。

精漿是精子發育、成熟的內環境，起著中和、緩沖、保護精子的作用。精漿中各生化指標的變化會影響精子質量和受精能力，因此，精漿生化檢查對評估男性生育的影響有重要意義。鋅是體內合成多種酶的主要成分，與精子的發生、成熟、運輸及在女性生殖道內移動和獲能密切相關，當機體內鋅含量缺乏時，合成睪丸素酶發生紊亂，造成精子活動力下降;鋅還可以延緩精子細胞膜的脂質氧化，起到維持細胞膜結構的穩定性和通透性作用，從而保持精子活力[14]。關于精液參數與精漿鋅的相關性，一些研究者認為精漿鋅水平與精子濃度、活力有關，如我國學者劉海儒等[15]研究發現精漿鋅含量與精子總數、前向運動精子總數和IVF受精率關系密切，精漿鋅含量是評估男性生殖力的重要指標之一。然而，有研究者卻得出相反的結論，如張東梅等[16]研究發現精漿鋅含量降低可導致精子密度下降，但對精子活力和形態沒有顯著影響。目前結論尚未統一。本研究結果顯示弱精子癥患者精漿鋅含量與對照組相比無顯著差異，可能是由于精漿鋅含量較低，其組間差異和相關性在小樣本檢測中不易被發現。精漿果糖由精囊腺分泌，是精子獲能的主要來源，精囊腺功能紊亂時，果糖含量降低，引起精子活動力下降，導致弱精子癥。本研究分析表明，果糖含量降低時，精子活力亦下降，二者呈正相關。

近年來，在治療弱精子癥中常采用精子體外處理技術來提高精子的運動能力和穿透力。

本研究結果表明，GRP78蛋白表達水平可能是影響精子運動能力的一個重要因素。但本研究僅間接揭示了GRP78水平與精子PR百分率的關系，尚未對GRP78影響精子PR百分率的具體機制進行研究。此外，通過研究，發現GRP78蛋白水平和精漿果糖水平與弱精子癥存在一定的相關性，表明GRP78與精漿生化聯合檢查對評估男性生育能力有一定的意義。但是有關GRP78 影響精子活動力的具體機制仍有待進一步研究。

參 考 文 獻

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（收稿日期：2019-09-23 修回日期：2019-10-28）

（編輯：潘明志）

基金項目：廣西自然科學基金面上項目（2018GXNSFAA050034）;廣西衛生和計劃生育委員會自籌經費科研課題（Z20170234，Z20170236）;廣西教育廳高校中青年教師基礎能力提升項目（2018KY0437）

作者簡介：韋玉霞，女，主管技師，在讀碩士研究生，研究方向：生殖免疫。E-mail：359627186@qq.com

通信作者：陳學杰。E-mail：xuejiechen1970@126.com

[本文引用格式]韋玉霞，李潔，龐曉霞，等.葡萄糖調節蛋白78及精漿生化與弱精子癥的相關性研究[J].右江醫學，2019，47（11）：810-814.