豬骨髓間充質干細胞體外構建軟骨修復關節軟骨缺損的實驗研究

宋楠 何愛娟

軟骨缺損臨床較為常見，因其自我修復能力低，多需進行自體軟骨移植以重建關節功能[1-3]。組織工程技術為關節軟骨缺損修復提供了嶄新的思路，有望解決目前關節軟骨缺損修復面臨的困難。

BMSC 具有軟骨形成能力強、來源廣泛、獲取損傷輕、無供區缺損、可重復取材等優勢，是關節軟骨缺損修復的理想種子細胞。前期研究已證實，應用BMSCs 復合聚羥基乙酸/多聚乳酸（PGA/PLA）可成功修復大動物關節軟骨缺損[4-5]，但軟骨體內再生的穩定性不足，成功率較低。另有研究表明，大量PGA支架材料及其降解產物在體內可引發炎癥反應，從而干擾軟骨的體內再生。因此，將BMSCs 復合PGA/PLA 支架體外共培養，待支架材料大部分降解后再植入體內，或可獲得更為理想的修復效果。然而，目前仍不清楚BMSCs 體外構建軟骨植入體內后是否能進一步成熟并修復軟骨缺損。

為此，我們以豬為實驗動物，建立大面積關節軟骨缺損模型，用自體BMSCs 體外構建的軟骨移植修復缺損，評估BMSCs 體外構建軟骨修復關節軟骨的可行性及其長期功能轉歸，并同時檢測關節液中IGF-1、IL-1β、MMP-13 及TNF-α 的表達，以初步闡述該方法是否可避免或延緩骨關節炎的發生、發展。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組

普通健康長楓雜交豬（上海青浦養豬場），4～6 月齡，體質量15～30 Kg 不等，雌雄不限（n=7）。后肢膝關節股骨內外側髁制備直徑10 mm 的全厚軟骨缺損，以BMSCs 體外構建軟骨進行修復（實驗組，n=7）；創面曠置作為空白對照組（n=3）；單純PGA/PLA 材料修復作為單純材料組（n=5）；正常關節作為正常對照組（n=13）。

1.2 實驗材料

DMEM 培養液、ITS（Gibco，美國）；L-谷氨酰胺、維生素C、0.25%胰蛋白酶（Sigma，美國）；青霉素、鏈霉素（上海新華制藥廠）；10%胎牛血清（HYCLONE，美國）；100 mm 培養皿、0.22 μm 目濾器、50 mL 離心管、6 孔培養板（Falcon，美國）；TGF-β1（每支20 μg，Intergen，美國）；IGF-1（每支50 μg，Intergen，美國）；地塞米松（2 mg/mL，Sigma，美國）；非編織聚羥基乙酸纖維（PGA，上海國睿生命科技有限公司）；單克隆抗體ab34712（Abcam，英國）。

1.3 BMSCs 分離培養及擴增

每只實驗動物抽取10 mL 骨髓，全血培養法培養BMSCs 原代細胞[6]。將接種好的培養皿置于37 ℃、5%CO2、100%飽和濕度條件下培養5 d 后首次換液，加入PBS 緩沖液反復漂洗，去除未貼壁血細胞，加入新鮮培養液繼續培養。待細胞接近70%～80%融合時進行傳代培養。收集第2 代細胞用于后續實驗。

1.4 PGA/PLA 支架材料的制備

取非編織聚羥基乙酸（PGA）15 mg，放入圓形注射器中，加入少許無水乙醇將其壓制成型，滴加1%（1 g 的PLA 溶于100 mL 的二氯甲烷）的PLA 塑形，制成直徑10 mm、厚度2 mm 的PGA/PLA 支架。將制備好的支架材料滅菌后預培養48 h，確定無污染后用于細胞接種。

1.5 細胞-材料復合物的制備

第2 代BMSCs 離心棄上清，新鮮培養液重懸細胞，調整細胞濃度為50×106cells/mL。以無菌滴管吸取細胞懸液均勻滴種在支架材料上（每塊材料接種約0.1 mL 細胞懸液），置于37 ℃、5%CO2、100%飽和濕度下孵育4 h，加入含10%FBS 的DMEM 培養液培養2 d，換軟骨誘導液（含0.3 g/L L-谷氨酰胺、0.05 g/L抗壞血酸、3.7 g/L 碳酸氫鈉、10 萬U/L 青霉素鉀、0.1 g/L 硫酸鏈霉素，10 ng/mL TGF-β1、100 ng/mL IGF-I、1%ITS、40 ng/mL 地塞米松的高糖DMEM 培養液）進行軟骨定向誘導。每隔2 d 全量換液，倒置顯微鏡觀察細胞基質分泌情況，以及與PGA 纖維的黏附情況。

1.6 構建軟骨的大體觀察、組織學檢測

細胞材料復合物體外培養8 周時，每只動物各取1 個樣本進行大體觀察和組織學檢測。HE 染色觀察細胞形態；Safranin-O 染色觀察細胞外基質中GAG 的合成和分泌情況；免疫組化觀察細胞Ⅱ膠原蛋白的合成和分泌情況[6]。

1.7 缺損修復

實驗組用體外誘導了8 周的組織工程軟骨植入缺損處，5-0 可吸收縫線縫合固定（圖1）；空白對照組創面曠置；材料對照組以PGA/PLA 材料修復缺損；以正常關節作為正常對照組。

圖1 關節軟骨缺損的修復模型Fig.1 Repair model of articular cartilage defect

1.8 組織學檢測

術后6 個月取材行大體觀及組織學檢測。大體觀察修復區軟骨的大小、形態、色澤、表面情況、修復厚度及其相鄰正常關節軟骨的界面愈合情況，同時沿軟骨修復區中線鋸開關節，觀察修復區軟骨與軟骨下骨的界面愈合情況。

HE 染色觀察修復區有無軟骨細胞修復、細胞排列情況、與周圍正常關節軟骨及軟骨下骨的界面愈合情況、修復區域的厚度及平整度、細胞外基質的沉積情況等。

1.9 關節液細胞因子檢測

術前及術后6 個月時抽取豬關節液，檢測關節液的IGF-1、IL-1β、MMP-13 及TNF-α 因子的表達水平（n=3）[6]。

1.10 統計學處理

2 結果

2.1 BMSCs 體外構建軟骨大體觀及組織學檢測

體外軟骨構建8 周后，實驗組修復處形成了表面光滑、瓷白色的軟骨樣組織。HE 染色可見明顯的軟骨陷窩結構，陷窩周圍均有藍染的細胞外基質沉積；Safranin-O 染色及免疫組化顯示，軟骨陷窩周圍有大量的GAG 及Ⅱ型膠原蛋白沉積。這些結果說明體外誘導8 周后，BMSCs 已形成了成熟的軟骨組織，并能大量分泌軟骨特異性細胞外基質（圖2）。

圖2 BMSCs 體外構建軟骨大體觀及組織學檢測Fig.2 Gross observation and histological detection of cartilage constructed by BMSCs in vitro

2.2 軟骨修復大體觀

實驗組缺損區均有新生軟骨組織形成，其表面光滑，色澤、質地、強度與周圍正常軟骨類似。剖面觀可見新生軟骨組織與周圍正常軟骨組織及軟骨下骨組織界面愈合良好，且修復區軟骨厚度與周圍正常關節軟骨未見明顯差異。單純材料組缺損邊緣雖有少量軟骨細胞爬入，但中央區主要表現為纖維結締組織樣組織修復，關節面軟骨負重區多有磨損變薄、軟骨下骨隱約可見，出現骨關節炎表現。這些結果說明，BMSCs 體外構建軟骨可修復自體關節軟骨缺損，可有效避免或延緩骨關節炎的發生。統計修復率結果顯示，實驗組基本修復；單純材料組僅1 例有部分缺損修復；空白對照組均無修復（圖3、4）。

圖3 術后6 個月取材大體觀及剖面觀Fig.3 Gross and cross section view of repaired defects 6 months after operation

2.3 骨關節炎相關細胞因子檢測

術后6 個月，實驗組關節液中IGF-1 水平顯著高于空白對照組和單純材料組（P＜0.05）；而IL-1β、MMP-13、TNF-α 的表達顯著低于空白對照組和單純材料組（P＜0.05）。提示BMSCs 體外構建軟骨不僅可以修復關節軟骨缺損，還能有效減緩或避免骨關節炎的發生、發展（圖5）。

圖5 關節液中細胞因子的變化情況Fig.5 Changes of cytokines in joint fluid

3 討論

組織工程技術修復關節軟骨缺損尚停滯于臨床前的大動物實驗階段。本研究發現，應用BMSCs 體外構建的組織工程軟骨可成功修復豬自體的關節軟骨缺損，且新生軟骨組織與周圍正常的骨、軟骨組織界面愈合良好，其組織學特性與天然軟骨也十分接近。更重要的是，組織工程軟骨修復軟骨缺損后能有效減緩或避免骨關節炎的發生和發展。

軟骨損傷是常見的運動損傷之一，尤其是關節軟骨損傷。隨著人口老齡化趨勢的發展，關節炎導致的軟骨缺損也在逐年劇增。本研究發現，利用豬自體的BMSCs 可在體外構建成熟穩定的軟骨組織，同時根據缺損的大小與形狀，還可以在體外構建出個性化的具有特定形態且功能正常的軟骨組織；且這些組織工程軟骨能有效修復自體關節軟骨缺損。這為組織工程軟骨的臨床應用提供了理論基礎。

盡管大部分BMSCs 構建的軟骨植入體內后都獲得了較為理想的軟骨再生效果，但我們也發現實驗組中有些個體的修復效果未盡如人意，出現了纖維結締組織樣修復并伴有骨關節炎樣表現。根據既往文獻報道，我們推測導致軟骨缺損修復效果欠佳的原因可能有以下幾方面：①軟骨下骨出血。為了能植入厚度約為3 mm 的軟骨組織，術中我們刮除了厚度約0.5 mm 的軟骨下骨組織。刮除軟骨下骨過程中出血量大，止血困難，將組織工程軟骨植入軟骨缺損區后，軟骨下骨仍繼續出血，直至將軟骨充分固定后出血才停止。因此，植入的組織工程軟骨與軟骨下骨之間有較大的血腫存在。文獻報道，軟骨修復手術造成的滑膜、軟骨下骨出血會刺激創面大量白細胞滲出并釋放大量的炎癥因子，而導致軟組織反應性水腫和關節積液；此外，關節內積血還導致纖溶酶激活。這些因素破壞了關節內環境的穩態[7]。軟骨由于沒有血供，營養來源于關節液，關節內環境的紊亂干擾了軟骨、軟骨下骨的正常營養成分供給，導致軟骨無法獲得正常的營養，從而影響植入軟骨的進一步成熟[8]，影響修復效果。②手術創傷過大，植入物缺乏合適力學刺激微環境。本研究中，實驗動物的雙側膝關節的股骨髁均同時做了大面積（直徑10 mm）全厚軟骨缺損，損傷較大。軟骨基質中的GAG 有吸水膨脹的特性，使得軟骨像海綿一樣，在不受到壓力時能源源不斷地將關節液中的營養成分吸入軟骨組織內，而在受壓變形時又可將代謝產物與關節液擠出軟骨組織從而排出代謝產物。因此，適當的力學刺激對軟骨的營養代謝至關重要。但是，術后軟骨下骨淤血、關節腔內積液等不僅引起關節腔內結締組織增生、黏連，還可引起關節腔內壓、骨內壓增高[9-10]，加重了實驗動物術后的疼痛感，導致實驗動物活動減少，進一步加重了術后關節黏連[11]。由于缺乏合適的力學刺激，從而大大影響了軟骨營養物質的攝入及代謝產物的排出。這些因素相互作用加重了關節內環境紊亂，嚴重影響植入軟骨的營養代謝和物質運輸，從而影響修復效果。③另一個重要影響因素是動物術后負重過早。由于實驗動物雙下肢的內外側髁同時做軟骨修復手術，為維持基本生活，大部分實驗動物于術后1 周內開始負重，而目前臨床上自體關節軟骨移植手術普遍實行術后早期被動活動、術后6 周開始負重。從體外構建軟骨的彈性模量來看，體外構建8 周的軟骨，其彈性模量只達到正常關節軟骨的30.61%，抗壓強度遠低于正常關節軟骨，這間接說明了體外構建的軟骨并不足以承重[12-14]。因此，術后負重過早或導致了植入的軟骨受到過大的壓強，使其膠原纖維斷裂、結構破壞，而影響修復效果。

綜上所述，本實驗證實了應用自體BMSCs 體外構建的組織工程軟骨，能有效修復豬膝關節大面積全厚關節軟骨缺損，但是由于受手術創傷、術后關節內環境變化、過早負重等因素影響，其修復效果有待進一步提高。此外，影響關節修復效果的關鍵因素及其作用機制仍需進一步驗證。本研究為組織工程軟骨的臨床應用提供了重要的實驗基礎。