CIN及宮頸癌患者外周血調節性T細胞的表達及意義

唐婷婷 趙曼曼

[摘要] 目的 探討CIN及宮頸癌患者外周血調節性T細胞的表達及意義。 方法 選取2014年1月～2018年12月我院收治的CIN（宮頸上皮內瘤變）患者20例，宮頸癌患者40例，其中Ⅰ～Ⅱ期20例、Ⅲ～Ⅳ期20例，同時選擇健康志愿者20例作為對照組。采用流式細胞儀檢測調節性T細胞，酶聯免疫吸附法測定相關細胞因子。 結果 CIN及宮頸癌患者外周血中調節性T細胞的水平顯著高于對照組，差異具有統計學意義（P<0.01）。 結論 CIN及宮頸癌患者調節性T細胞/Th17細胞間的平衡被打破，可能導致了CIN的進展及宮頸癌的發生發展。

[關鍵詞] CIN;宮頸癌;調節性T細胞;IL-17;IL-10

[中圖分類號] R711.7 ? ? ? ? ?[文獻標識碼] A ? ? ? ? ?[文章編號] 1673-9701（2019）31-0015-03

Expression and significance of regulatory T cells in peripheral blood of patients with CIN and cervical cancer

TANG Tingting ? ZHAO Manman

Department of Obstetrics and Gynecology， Shenyang Fourth People's Hospital， Shenyang ? 110031，China

[Abstract] Objective To study the expression and significance of regulatory T cells in the peripheral blood of patients with CIN and cervical cancer. Methods Twenty patients with CIN （cervical intraepithelial neoplasia） and 40 patients with cervical cancer （including 20 patients with stage Ⅰ-Ⅱ cancer and 20 patients with stage Ⅲ-Ⅳ cancer） treated in our hospital from January 2014 to December 2018 were enrolled， and 20 healthy volunteers were selected as the control group. Regulatory T cells were detected by flow cytometry， and relevant cytokines were determined by enzyme-linked immunosorbent assay. Results The levels and function of regulatory T cells in peripheral blood of patients with CIN and cervical cancer were significantly higher than those of the control group， with statistically significant differences（P<0.01）. Conclusion The balance between regulatory T cells/Th17 cells in the patients with CIN and cervical cancer is destroyed， which may lead to the progress of CIN and the occurrence and development of cervical cancer.

[Key words] CIN; Cervical cancer; Regulatory T cells; IL-17; IL-10

宮頸癌作為婦科發病率較高的惡性腫瘤，正呈逐年上升的趨勢，嚴重威脅著婦女們的生命健康。而宮頸上皮內瘤變（CIN）是宮頸癌前病變的主要疾病狀態，對宮頸癌的發生發展具有重要的促進作用。Th17/Treg是CD4+T細胞的兩種亞群，正常情況下，Th17/Treg細胞之間保持平衡，然而大量研究表明多種惡性腫瘤患者腫瘤組織和外周血中均出現輔助性T細胞17（Th17）/調節性T細胞（regulatory T cells，Treg）失衡，因此，認為Th17/Treg 細胞失衡與腫瘤進展關系密切[1-2]。

有研究者發現，CD4+CD25+Treg細胞在低級別CIN患者中輕度增高，在高級別CIN患者中，尤其是宮頸癌患者中顯著增高[3]。同時發現CIN及宮頸癌患者中調節性T細胞數量增高者預后較差，無病生存期明顯縮短，提示調節性T細胞可能是CINIII及宮頸癌的獨立預后因素[4]。CD4+CD25+Treg細胞能分泌白細胞介素10（IL-10），IL-10是一種能調節細胞生長和分化并參與炎癥和免疫反應的多功能細胞因子[5]。輔助性Th17型細胞以分泌IL-17為特征，可通過誘導產生多種前炎性細胞因子，參與構成腫瘤微環境[6]。有研究證實宮頸癌患者中外周血血清IL-10、IL-17的水平顯著升高[4-5]。因此，本研究主要探討人外周血CD4+CD25+Treg細胞數和血清IL-10，IL-17水平的變化與CIN及宮頸癌患者之間的關系，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇CIN（宮頸上皮內瘤變）患者20例，宮頸癌患者40例，其中Ⅰ～Ⅱ期20例（Ⅰ期9例，Ⅱ期11例）、Ⅲ～Ⅳ期20例（Ⅲ期13例，Ⅳ期7例），均選自沈陽市第四人民醫院2014年1月～2018年12月就診的患者，且經手術及病理學檢查確診的患者。CIN組中，年齡35～60歲，平均（42.5±9.5）歲，宮頸癌組中，年齡32～64歲，平均（46.4±9.0）歲，均未進行過放、化療及激素或免疫等抗腫瘤治療。對照組根據年齡匹配選取20名健康志愿者，年齡36～55歲，平均（44.2±8.5）歲。各組年齡比較差異無統計學意義（P>0.05），具有可比性。本研究獲醫院倫理委員會批準，所有被檢者均簽署知情同意書。

1.2 外周血CD4+CD25+Treg細胞檢測

采集各組研究對象外周血2.5 mL，置于EDTA抗凝管中，加入淋巴細胞分離液，離心，分離獲得PBMC，計數。取1×106 PBMC，加入anti-CD4-FITC及anti-CD25-APC進行細胞表面染色，4℃，2 h。破膜固定后，加入anti-Foxp3-PE進行胞內染色，清洗，重懸細胞，上機檢測。anti-CD4-FITC、anti-CD25-APC及anti-Foxp3-PE均購自美國BD bioscience公司。

1.3 酶聯免疫吸附法（ELISA）檢測IL-17、IL-10的分泌水平

抽取各組研究對象外周血，室溫靜置2 h，1500 rpm，離心30 min，分離上清，-70℃保存，待測。取100 μL稀釋的血清樣品或梯度稀釋的標準品，加入預先包被好的96孔板中。室溫孵育2 h，PBS洗板3次。加入檢測抗體100 μL，室溫孵育2 h，PBS洗板3次。加入Streptavidin-HRP 100 μL，避光孵育20 min，洗板3次。加底物避光室溫孵育30 min，加終止液50 μL。利用酶標儀，在450 nm處讀板計算蛋白濃度。

1.4 統計學分析

采用SPSS22.0統計軟件進行數據分析，計量資料用均數±標準差（x±s）表示，采用單因素方差分析比較各組間的統計學差異，當差異有統計學意義時，采用SNK法進行組間比較，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組外周血中CD4+CD25+Foxp3+調節性T細胞及特異性轉錄因子Foxp3表達水平比較

采用流式細胞術檢測各組外周血CD4+CD25+Foxp3+調節性T細胞的表達水平，結果表明，CIN組及宮頸癌患者外周血中CD4+CD25+Foxp3+調節性T細胞較對照組顯著升高，差異具有統計學意義（P<0.01）。見表1。

2.2 各組外周血中IL-17及IL-10分泌水平比較

用酶聯免疫吸附法檢測對照組、CIN患者及宮頸癌患者外周血血清中細胞因子的分泌水平。結果顯示，CIN及宮頸癌患者血清中IL-10、IL-17的分泌水平較對照組明顯升高，差異均具有統計學意義（P<0.01）。見表2。

3 討論

進入21世紀，女性癌癥的發病率很高，宮頸癌是女性最常見的惡性腫瘤之一，其發病率居婦科惡性腫瘤的第三位[7]。CIN是宮頸癌前病變，其持續發展即為宮頸癌。近年來有研究發現，腫瘤的發生發展與機體的免疫狀態密切相關，大量研究表明惡性腫瘤患者的免疫系統處于免疫耐受或免疫缺陷狀態，可以逃逸機體的抗腫瘤免疫反應[8]。有研究指出，當 Treg/Th17的平衡發生偏離時則會引起CIN的進展甚至導致宮頸癌的發生與惡化[9]。

調節性T細胞是一類具有免疫抑制功能的T細胞亞群，以表達CD4、CD25為特征性表型，不僅能對抗外源性抗原，還可以抑制對抗自身抗原的免疫應答，從而輔助腫瘤細胞逃避機體免疫系統的識別及清除[10]。研究表明調節性T細胞在婦科腫瘤的發生發展中發揮了重要的作用。調節性T細胞介導宮頸癌的免疫逃逸[11-12]。研究顯示，在子宮內膜癌、卵巢癌、乳腺癌等多種腫瘤患者外周血中調節性T細胞的比例均顯著升高[13-15]。

腫瘤免疫微環境是近年來的研究熱點，免疫系統一方面可以通過免疫監控，抑制腫瘤發生;另一方面腫瘤組織發揮負向調控免疫系統，誘導免疫耐受，促進腫瘤惡性進展。因此，闡明宮頸癌微環境的免疫調控機制可為宮頸癌的預防及治療提供理論基礎。由于免疫調控是一個極為復雜的調控網絡，宮頸癌發病機制及其具體深入的免疫調控作用仍需進一步研究證實。

本研究中，CIN及宮頸癌患者外周血中調節性T細胞的數量及功能均有明顯升高，表明調節性T細胞參與了調控CIN及宮頸癌發生發展。IL-10是調節性T細胞發揮免疫抑制功能的主要細胞因子，參與調控多種腫瘤的發生發展。在CIN及宮頸癌患者外周血中，IL-10的分泌水平顯著增加，表明調節性T細胞可能同樣通過分泌IL-10來發揮其對CIN及宮頸癌病理進程的調控作用。另一方面，以分泌IL-17為主要特征的Th17型免疫細胞被證實參與CIN及宮頸癌的發生發展。本研究中，CIN及宮頸癌患者外周血中IL-17的分泌水平顯著升高，提示Th17型炎癥反應在CIN及宮頸癌中被大量誘導。調節性T細胞和Th17細胞均顯著增加，意味著調節性T細胞和Th17細胞間相互平衡被打破，形成了有利于腫瘤發展的免疫炎性微環境。

綜上所述，隨著CIN逐漸發展為宮頸癌，輔助性T細胞17（Th17）/調節性T細胞（regulatory T cells，Treg）細胞失衡，從而導致CIN及宮頸癌的發生發展，可能參與了腫瘤免疫內環境的調節。

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（收稿日期：2019-05-20）