大連龍湖濕地產油真菌的篩選及其產油率測定

李季蓉 楊紅 劉曉輝 姜慧明 李林翰

摘要：采用蘇丹黑B染色法從大連龍湖濕土壤中地分離獲得5株可產油真菌。經形態學鑒定，分別是土曲霉（Aspergillus terreus）、淡紫擬青霉（Paecilomyces lilacinus）、氈狀枝頂孢（Acremonium kiliense）、朱黃青霉（Penicillium minioluteuin）、橘黃青霉（Penicillium aurantiogriseurn）。采用酸熱法破碎細胞、甲醇—氯仿法進行了油脂的提取并計算，確定其中土曲霉產油率最高，產油率為47.6%。

關鍵詞：濕地;篩選;產油真菌

中圖分類號：Q939 文獻標識碼：A 文章編號：1674-9944（2019）22-0180-03

1 引言

隨著全球社會經濟的發展和人類對自然資源的開發利用，石化資源已經成為關系到各國經濟發展的重要資源[1]，包括微生物油脂資源在內的生物能源開發已經成為世界各國的研究熱點[2～4]。微生物生長具有生長周期短、可再生、易發酵培養等特點而備受關注，早期國外研究者就從灰綠青霉（Penicillium glaucum）抱子中抽提出7%的脂肪[5]，截至目前已有部分微生物的油脂產物已在食品領域得以應用[6]。本文通過從濕地土壤環境中分離獲得不同種類真菌菌株中篩選出具有產油能力的絲狀真菌，并對其產油率進行測定，為微生物能源開發提供重要生物資源。

2 材料與方法

2.1 試驗材料

樣品采集：通過5點取樣法從大連龍湖濕地土壤中取樣，將采集的樣品裝到無菌的離心管（50mL）中帶回實驗室，4℃冰箱保存，48h內分離完畢。

試驗中使用的主要試劑：孟加拉紅培養基粉（MEA）;馬鈴薯土豆瓊脂培養基粉（PDA）;限氮培養基：葡萄糖40g，硫酸銨2g，磷酸二氫鉀7g，磷酸氫鈉2g，酵母粉1g，硫酸鎂1.5g，1000mL水;蘇丹黑B、甲醇、氯仿等。

2.2 試驗方法

2.2.1 真菌菌株的分離純化

采用稀釋分離法在MEA培養基上培養5～10d，盡可能多地分離獲得可培養的絲狀真菌，再用PDA培養基對各個菌株進行純化培養。

2.2.2 產油絲狀真菌篩選及油脂提取

將分離純化的種菌株接人限氮培養基內，于28℃180r/min的恒溫搖床上培養5d后，收集菌體以備用。將離心后得到的菌球用濾紙過濾后輕壓風干，取菌體浸于蘇丹黑B染液中10min，再用95%酒精漂洗，至使濾紙呈現白色，觀察菌體顏色，若帶有藍黑色則說明帶有脂類物質。記錄菌株代號及菌體染色顏色程度。

2.2.3 油脂提取及產油率的計算

產油菌株在限氮培養基中培養7d，采用酸熱法將真菌細胞破碎[7]。破碎的真菌細胞液利用甲醇一氯仿法抽提油脂，液體中加入10ml，甲醇和10ml.氯仿，充分震蕩后于常溫，5000r/min下離心10min，取出下層氯仿層，向其中加入等體積的0.1%的氯化鈉溶液，混勻，離心，取出氯仿層。將氯仿層溶液置于旋轉蒸發儀上旋轉蒸發蒸去除氯仿，于105℃烘1h，冷卻后即得油脂，稱重。

產油率=油脂質量/菌體干質量×100

2.2.4 產油真菌的鑒定

觀察真菌菌落顏色、生長速度、質地等特征，同時顯微鏡下觀察真菌抱子形狀、顏色、產孢結構、菌絲分隔等特征，查閱相關真菌鑒定文獻，對產油真菌進行形態分類地位鑒定。

3 結果與討論

3.1 濕地真菌分離及產油真菌的初篩

通過稀釋培養法從采集的樣品中共分離純化出35個菌株，經限氮培養基發酵培養后，菌體經蘇丹黑B然后烘干后，得到5株產生深色脂類物質的真菌，菌株標號分別為Y-1，Y-5，Y-8，Y-13，Y-19，具體染色結果如圖1～5。

3.2 5株產油真菌產油率比較

如圖6所示，5株真菌產油率差別較大，其中土曲霉產油率最高47.6%，其次是朱黃青霉22%。淡紫擬青霉、氈狀枝頂抱和橘黃青霉產油率分別為17.6%、14.5%，而橘黃青霉產油率最低，僅為6.1%。

3.3 5株產油真菌的形態鑒定

經形態學觀察鑒定，5株可產油真菌分為是Y-8土曲霉（Aspergillus terreus），Y～19淡紫擬青霉（Paecilomyces lilacinus）、Y-5氈狀枝頂抱（Acremoni-um kiliense）、Y-13朱黃青霉（Penicilliumminiolute-um）、Y-1橘黃青霉（Penicillium aurantiogriseum），如圖7。

本文從濕地土壤中分離獲得的1株產油率較高的絲狀真菌土曲霉（Aspergillus terreus），為微生物油脂資源開發提供重要菌種資源，同時也將對該菌株的發酵優化條件及產油機理展開進一步深入研究。

參考文獻：

[1]王萍，張銀波，江木蘭，等.多不飽和脂肪酸的研究進展[J].中國油脂，2008，33（12）：42～46.

[2]林粵順，景旭東，周紅軍，等.微生物油脂研究進展[J].仲愷農業工程學院學報，2015，28（3）：66～70.

[3]易紹金，鄭義平.產油微生物的研究及其應用[J].中外能源，2006（2）：90～94.

[4]Patricia S，Berndha R.Rainer K， et al.A sensitive，viable colonystaining method using Nile red fordirect screening of bacteria thataccumulate polyhydroxyalkanoic acids and other lipid storage com-pounds[J].ArchMicrobiol，1999（171）：73～80.

[5]Hockenhaull D T D.Progress in industrial microbiology[J].Hey-wood of Company LTD，1959（1）：191～208.

[6]黃建忠，施巧琴，周曉蘭，等.深黃被抱霉高產脂變株的選育及其發酵的研究[J].微生物學通報，1998（4）：187～191.

[7]林義，鐘添華，駱祝華，等.尼羅紅染色法篩選產油酵母及定量檢測胞內油脂含量的研究[J].微生物學通報，2012，39（1）：125～137.

收稿日期：2019-10-31

基金項目：國家自然科學青年基金項目（編號：31800007）;大連民族大學創新訓練項目（編號：201812026063）

作者簡介：李季蓉（1997-），女，大連民族大學環境與資源學院學生。

通訊作者：楊紅（1978-），女，副教授，博士，研究方向為真菌分類。